Инструментальные методы анализа

22.3. Хроматографические параметры

Расположение разделяемых веществ в виде отдельных зон вдоль колонки называют внутренней хроматограммой, а графическое изображение состава элюата (подвижной фазы, содержащей разделённые вещества), выходящего из колонки, получаемое, например, с помо-

щью самописца - внешней хроматограммой.

Основные характеристики внешней хроматограммы, получаемой при элюентном хроматографическом анализе

Часть хроматограммы, соответствующая выходу из колонки чистого элюента (например, газа-носителя), называется нулевой линией. Часть хроматограммы, соответствующая выходу из колонки элюента вместе с компонентом разделяемой смеси, называется пиком. Для описания хроматографического пика используются следующие характеристики (рис. 22.1).

Отрезок нулевой линии, заключенный между крайними точками пика (в данном случае A и В), называется основанием пика. Часть основания пика, заключённая между точками пересечения касательных, проведённых к точкам перегиба на сторонах пика (G и G’), с нулевой линией (точки C и D), называется шириной пика (w - от англ. width). Расстояние от вершины пика до его основания, измеренное параллельно оси ординат, называется высотой пика (h - от англ. hight). Отрезок прямой, проведённой параллельно нулевой линии на половине высоты пика, заключённый между точками её пересечения с касательными (в данном случае точками E и F), называется шириной пи-

ка на половине высоты (w0,5).

283

Раздел 3

Хроматографические характеристики, используемые для идентификации веществ (характеристики удерживания)

Время от момента ввода пробы до момента регистрации макси-

мума пика называется временем удерживания (tR).

stationary ts

В идеальном случае время удерживания не зависит от концентрации вещества, но зависит от его природы, а также от природы подвижной и неподвижной фазы и условий хроматографирования. Время удерживания вещества зависит от упаковки сорбента и поэтому может изменяться при переходе от одной колонки к другой. Более надёжной характеристикой является исправленное время удерживания ( t′R ),

которое равно разности между временем удерживания данного вещества и несорбируемого компонента (t0). Поскольку t0 = tm, то t′R = tS.

Объём подвижной фазы, который необходимо пропустить через колонку с определённой скоростью для того, чтобы элюировать вещество, называется удерживаемым объёмом (VR). Аналогично понятию исправленное время удерживания существует понятие исправленный удерживаемый объём ( VR′ )

где F - объёмная скорость подвижной фазы (см3/мин)

Отношение равновесной концентрации вещества в неподвижной фазе (Cs) к его равновесной концентрации в подвижной фазе (Сm) на-

зывается коэффициентом распределения (D).

D = Cs

Cm

Удерживаемый объём связан с коэффициентом распределения уравнением, называемым основным уравнением хроматографии:

Произведение коэффициента распределения на соотношение объёмов неподвижной и подвижной фазы называется коэффициен-

том ёмкости колонки ( k′)

284

Инструментальные методы анализа

Хроматографические характеристики, используемые для количественного определения веществ

В качестве аналитического сигнала в хроматографии использу-

ют высоту или площадь хроматографического пика, которые про-

порциональны содержанию вещества в хроматографической зоне.

с помощью электронного цифрового интегратора

ИЗМЕРЕНИЕ ПЛОЩАДИ ПИКА

S = 1/2w h' S = 0,96Sист S = w0,5 h S = 0,84Sист

Приёмы количественного определения, используемые в хроматографических методах, приведены в табл. 22.3.

Табл. 22.3.

Приёмы количественного определения в хроматографии

285

Раздел 3

Внутренний стандарт представляет собой специально добавляемое к анализируемой пробе в точно измеренном количестве вещество, свойства которого близки к свойствам определяемого вещества. Вещество, взятое в качестве внутреннего стандарта:

•не должно химически взаимодействовать с компонентами анализируемой смеси, с неподвижной или подвижной фазой;

•должно отсутствовать в исходной анализируемой смеси;

•давать пик, находящийся на хроматограмме в непосредственной близости от пиков определяемых веществ, но не накладывающийся на них и на пики других соединений.

Концентрацию внутреннего стандарта выбирают таким образом, чтобы высота (площадь) пика внутреннего стандарта была соизмерима с высотой (площадью) пика определяемого вещества (рис. 22.3).

Рис. 22.3. Хроматограмма, полученная при ГЖХ-определении аминазина

впечени (внутренний стандарт – бромгексин)

Вметоде внешнего и внутреннего стандарта используются одни и те же приёмы расчёта содержания вещества (метод градуировочного графика и др.). Основное различие заключается в характере используемого аналитического сигнала. Метод внутреннего стандарта обладает большей надёжностью и даёт более воспроизводимые результаты, особенно в случае сложной пробоподготовки.

22.4. Теории хроматографического разделения

При хроматографировании происходят два процесса: разделение веществ и размывание хроматографических зон разделяемых веществ. Хроматографический процесс заключается в многократном повторении актов сорбции и десорбции. Поскольку скорость сорбции и де-

286

Инструментальные методы анализа

сорбции для молекул различных веществ различна, то после повторения большого числа элементарных актов хроматографического разделения при прохождении смеси веществ через слой сорбента происходит разделение её на отдельные компоненты. Положение и вид хроматографических зон разделяемых веществ зависят от формы изотермы сорбции, скорости установления равновесия, степени диффузии вещества в подвижной фазе.

Изотермой сорбции называется зависимость концентрации вещества, сорбированного неподвижной фазой, от его концентрации в подвижной фазе при постоянной температуре. Если изотерма сорбции линейна, установление равновесия происходит мгновенно и степень диффузии вещества в подвижной фазе пренебрежимо мала, идеальный хроматографический пик описывается кривой нормального распределения.

Для объяснения причин размывания хроматографических зон используются две теории: теоретических тарелок и кинетическая теория.

Теория теоретических тарелок предполагает, что:

•каждая хроматографическая колонка состоит из некоторого количества одинаковых по величине абстрактных узких слоёв, называемых теоретическими тарелками, на каждой тарелке происходит один элементарный акт сорбции-десорбции;

•на каждой тарелке происходит мгновенное установление равновесия между веществом, находящимся в подвижной и неподвижной фазе;

•переход вещества с одной тарелки на другую происходит дискретно - при попадании на тарелку новой порции элюента равновесие нарушается, и часть вещества мгновенно переносится на следующую тарелку, где вновь мгновенно наступает равновесие и т.д.;

•на любой тарелке в любой момент времени число сорбируемых частиц вещества значительно больше числа сорбируемых частиц растворителя, изотерма сорбции является линейной.

Количественной характеристикой хроматографической колонки являются: высота эквивалентная теоретической тарелке (H) и число теоретических тарелок (N).

Высота эквивалентная теоретической тарелке представляет собой дисперсию, приходящуюся на единицу длины колонки. Чем

287

Раздел 3

меньше H и больше N, тем в меньшей степени происходит размывание пика и тем эффективнее хроматографическое разделение (рис. 22.4).

Рис. 22.4. Хроматограммы вещества X, полученные на колонках с различ-

ной эффективностью (размерность оси абсцисс одинакова)

Число теоретических тарелок можно рассчитать:

где tR - время удерживания, kx - коэффициент, величина которого зависит того, на каком уровне измеряется ширина пика wx.

Если пик представляет собой кривую нормального распределения, то ширина пика у основания равна 4σ, на половине высоты - 2,35σ, на 60,7% высоты (между точками перегиба) - 2σ (рис. 22.5) и

т.д. При измерении ширины пика у основания коэффициент kx будет равен 16 (42), на половине высоты - 5,54 (2,352) и т.д.

Число теоретических тарелок является мерой эффективности колонки и обычно постоянно для всех пиков на хроматограмме. Так как N является постоянной величиной, то при увеличении времени удерживания ширина пика увеличивается.

288

Инструментальные методы анализа

Согласно кинетической теории хроматографии размывание хроматографических пиков обусловлено одновременным действием трёх независимых друг от друга процессов:

влияние обратно пропорционально

B скорости ПФ

продольная диффузия

РАЗМЫВАНИЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ПИКА

Суммарное влияние вихревой диффузии, продольной диффузии и сопротивления массопереносу на величину высоты эквивалентной теоретической тарелке описывается уравнением Ван-Деемтера.

H = A + UB + CU

где U - линейная скорость подвижной фазы

H

H= f (U)

CU

Hmin

A

B/U

Рис. 22.6. Зависимость H от линейной скорости газа-носителя

289

Раздел 3

Зависимость H от U для газовой хроматографии (насадочная колонка) показана на рис. 22.6. Оптимальную скорость газа-носителя, при которой величина Н минимальна, можно рассчитать по формуле:

Uопт = CB

В жидкостной хроматографии величина B практически не вносит вклад в размывание хроматографического пика (вязкость жидкости значительно больше вязкости газа), поэтому зависимость Н от U выглядит по-другому (как?).

Для характеристики эффективности разделения компонен-

тов смеси, используют коэффициент разделения (α) и разрешение (RS). Коэффициент разделения равен отношению исправленных

времён удерживания (а такжеVR′ , k′, D) веществ:

Если α = 1, то разделение невозможно.

Разрешение рассчитывается по следующей формуле:

Разделение двух пиков считается полным, если RS ≥ 1,5 (при RS = 1,5 расстояние между максимумами пиков составляет 6σ, степень перекрывания пиков 0,13%) - рис. 22.6.

RS = 4σ2 +6σ4σ =1,5

Рис. 22.6. Перекрывание пиков при различной величине RS

Число теоретических тарелок, необходимое для разделения с заданным разрешением, равно:

290