2006_-Byelorussian_Pharmacopoeia_Volume_1

Стандартный образец человеческого анти-D-иммуноглобулина BRP

калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом и предназначен для использования в количественных определениях человеческого

анти-D-иммуноглобулина.

МАТЕРИАЛЫ

Реагенты, для которых нет особых указаний, должны быть аналитической степени чистоты.

СФБ. 8,0 г натрия хлорида R, 0,76 г безводного натрия гидрофосфата R, 0,2 г калия хлорида R, 0,2 г калия дигидрофосфата R и 0,2 г натрия азида R

растворяют в воде R и разбавляют до 1000 мл тем же растворителем.

Раствор СФБ-БСА. СФБ, содержащий 10,0 г/л бычьего альбумина R.

Эритроциты. Используют D-положительные эритроциты, полученные из группы доноров с группой 0 R1R1 не более, чем за две недели до определения. При

необходимости хранят с соответствующим стабилизатором при 40С. Клетки промывают не менее двух раз раствором СФБ-БСА и готовят суспензию, содержащую 1×104, но не более 5×104 клеток в микролитре с использованием раствора СФБ-БСА.

Используют D-отрицательные эритроциты, полученные из группы доноров с группой 0 rr и подготовленные аналогичным образом.

Вторичные антитела. Используют подходящий фрагмент анти-IgG-антитела,

связанный с флуоресцентным красителем, обладающий специфичностью в отношении человеческого IgG или его частей. Хранят и используют в соответствии с инструкциями изготовителя.

Титрационные микропланшеты. Используют плоскодонные планшеты без поверхностной обработки для иммуноферментного анализа.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Испытуемые растворы. В случае лиофильно высушенных препаратов их

восстанавливают в соответствии с указаниями на этикетке. Готовят не менее чем в трех независимых повторностях не менее трех серийных полутора- или двукратных

разведений, начиная с концентрации в диапазоне 1,2–0,15 МЕ/мл с использованием

раствора СФБ-БСА. При необходимости, исходное разведение корректируют с целью получения откликов, попадающих в область линейности графика зависимости отклика от дозы.

Растворы сравнения. Восстанавливают препарат сравнения в соответствии с

указаниями на этикетке. Готовят не менее чем в трех независимых повторностях не

менее трех серийных полутора- или двукратных разведений, начиная с концентрации в диапазоне 1,2–0,15 МЕ/мл с использованием раствора СФБ-БСА.

При необходимости, исходное разведение корректируют с целью получения откликов, попадающих в область линейности графика зависимости отклика от дозы.

В каждую ячейку титрационного микропланшета распределяют по 50 мкл D- положительных эритроцитов. К содержимому ячеек каждого ряда добавляют по 50

мкл каждого из разведений испытуемого раствора или раствора сравнения. Используют 50 мкл раствора СФБ-БСА в качестве отрицательного контроля. По 50 мкл D-отрицательных эритроцитов распределяют в четыре ячейки того же микропланшета и добавляют по 50 мкл наименьшего разведения испытуемого препарата. Для отслеживания ложных реакций распределяют по 50 мкл D-

положительных эритроцитов в четыре ячейки того же микропланшета и добавляют

по 50 мкл раствора СФБ-БСА. Запечатывают пластиковой пленкой и инкубируют при

370С в течение 40 минут.

Планшеты центрифугируют при 50 g в течение 3 минут, отбрасывают

супернатант и промывают ячейки 200-250 мкл раствора СФБ-БСА. Повторяют промывку еще не менее одного раза.

Планшеты центрифугируют при 50 g в течение 3 минут, отбрасывают супернатант и добавляют по 50 мкл вторичного антитела, разбавленного раствором СФБ-БСА до подходящей концентрации белка. Запечатывают пластиковой пленкой и инкубируют при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 20

минут.

Планшеты центрифугируют при 50 g в течение 3 минут, отбрасывают

супернатант и промывают ячейки 200-250 мкл раствора СФБ-БСА. Повторяют промывку еще не менее одного раза.

Планшеты центрифугируют при 50 g в течение 3 минут, клетки ресуспендируют в 200-250 мкл раствора СФБ-БСА.

Суспензию клеток переносят в трубку, совместимую с имеющимся оборудованием для поточной цитометрии, и проводят дальнейшее разбавление

добавлением СФБ для обеспечения подходящей скорости потока.

Немедленно приступают к измерению медианной интенсивности

флуоресценции в поточном цитометре. Регистрируют не менее 10000 событий без

гейтинга, но с исключением шумов.

С использованием медианной интенсивности флуоресценции в области

линейности кривой зависимости отклика от дозы оценивают активность испытуемого

препарата обычными статистическими методами (5.3).

2.7.14. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕННОЙ (ИММУНОГЕННОЙ) АКТИВНОСТИ ВАКЦИНЫ ГЕПАТИТА А

Количественное определение вакцины гепатита А производят либо in vivo,

путем сравнения ее способности приводить в данных условиях к образованию

специфических антител у мышей с такой же способностью препарата сравнения, либо in vitro, путем иммунохимического определения содержания антигена.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ IN VIVO

Испытание на мышах, описанное ниже, приводится в качестве примера подходящего для данной вакцины метода; могут использоваться и другие методы с подтвержденной достоверностью.

Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют

здоровых мышей подходящей линии из одной партии, возрастом около 5 недель.

Используют животных одного пола. Животных делят не менее чем на семь равных групп; количество мышей в группе должно быть подходящим для выполнения

требований испытания.

Определение антигенной активности испытуемой вакцины. Готовят не

менее трех серийных разведений испытуемой вакцины и соответствующие разведения препарата сравнения с использованием раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, содержащего алюминийсодержащий адъювант, используемый

в вакцине. Каждое разведение назначают одной из групп мышей, каждой из которых

вводят подкожно не более 1,0 мл этого разведения. Контрольной

невакцинированной группе вводят подкожно такой же объем раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, содержащего адъювант, используемый в вакцине.

Через 28–32 дня всех животных анестезируют и производят забор крови. Индивидуальные сыворотки хранят отдельно друг от друга. Выполняют

количественное определение специфических антител к вирусу гепатита А в индивидуальных сыворотках, используя подходящий иммунохимический метод

(2.7.1).

Вычисления. Вычисления проводят обычными статистическими методами,

используемыми для количественных определений с конечным числом возможных результатов (5.3).

Из распределения уровней реакции, измеренных для всех сывороток группы

невакцинированных животных определяют максимальный ожидаемый уровень

реакции невакцинированного животного в данном количественном определении. При получении отклика, превышающего этот уровень, у вакцинированного животного, его

по определению считают результатом сероконверсии.

Производят подходящее преобразование (например, пробит-преобразование)

процентной численности животных с обнаруженной сероконверсией в каждой из

групп и анализируют данные в соответствии с моделью параллельных линий

логарифмической зависимости дозы от отклика. Активность препарата определяют

относительно препарата сравнения.

Условия достоверности. Результаты испытания являются достоверными,

если:

-как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, ED50 заключена в интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными животным,

-при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и параллельности,

-границы доверительного интервала относительной активности находятся между

33% и 300% от оцененного значения активности.

Требования к активности. Верхняя граница доверительного интервала (Р =

0,95) оцениваемой относительной активности должна быть не менее 1,0.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ IN VITRO

Выполняют иммунохимическое определение (2.7.1) содержания антигена с критериями приемлемости, валидированными в сравнении с испытанием in vivo.

Критерии приемлемости для данного препарата сравнения подлежат утверждению

компетентными органами с учетом данных валидации.

2.7.15. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАКЦИНЫ ГЕПАТИТА В (RDNA)

Количественное определение вакцины гепатита B (rDNA) производят либо in vivo, путем сравнения ее способности приводить в данных условиях к образованию специфических антител против поверхностного антигена гепатита В (HbsAg) у мышей или морских свинок с такой же способностью препарата сравнения, либо in vitro, путем иммунохимического определения содержания антигена.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ IN VIVO

Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют

здоровых мышей из одной партии, возрастом около 5 недель. Используемая в

данном испытании линия мышей должна обеспечивать получение существенного

уклона кривой зависимости отклика от дозы в отношении антигена; подходящими являются мыши гаплотипов H-2q и H-2d. Также могут использоваться здоровые

морские свинки из одной партии с массой тела от 300 до 350 г и возрастом около 7 недель. Используют животных одного пола. Животных делят не менее чем на семь равных групп; количество в группе должно быть подходящим для выполнения требований испытания.

Определение активности испытуемой вакцины. Готовят не менее трех

серийных разведений испытуемой вакцины и соответствующие разведения

препарата сравнения с использованием раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л с добавлением алюминийсодержащего адъюванта, используемого в вакцине,

или другого подходящего растворителя. Каждое из полученных разведений назначают одной из групп животных, каждому из которых вводят внутрибрюшинно не

более 1,0 мл этого разведения. Одну группу животных не вакцинируют, а вводят внутрибрюшинно такой же объем растворителя. Через подходящий промежуток времени (например, от 4 до 6 недель) всех животных анестезируют и производят забор крови. Индивидуальные сыворотки хранят отдельно друг от друга. Выполняют количественное определение специфических антител против HBsAg в

индивидуальных сыворотках, используя подходящий иммунохимический метод

(2.7.1).

Вычисления. Вычисления проводят обычными статистическими методами,

используемыми для количественных определений с конечным числом возможных результатов (5.3).

Из распределения уровней реакции, измеренных для всех сывороток группы невакцинированных животных, определяют максимальный ожидаемый уровень реакции невакцинированного животного в данном количественном определении. При получении отклика, превышающего этот уровень, у вакцинированного животного, его

по определению считают результатом сероконверсии.

Производят подходящее преобразование (например, пробит-преобразование)

процентной численности животных с обнаруженной сероконверсией в каждой из

групп и анализируют данные в соответствии с моделью параллельных линий

логарифмической зависимости дозы от отклика. Активность препарата определяют относительно активности препарата сравнения.

Условия достоверности. Результаты испытания являются достоверными,

если:

-как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, ED50 заключена в

интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными животным,

-при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и параллельности,

-границы доверительного интервала относительной активности находятся между 33% и 300% от оцененного значения активности.

Требования к активности. Верхняя граница доверительного интервала (Р = 0,95) оцениваемой относительной активности должна быть не менее 1,0.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ IN VITRO

Выполняют иммунохимическое определение (2.7.1) содержания антигена с

критериями приемлемости, валидированными в сравнении с испытанием in vivo.

Показано, что методы твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и

радиоиммунологического анализа (РИА) с использованием моноклональных антител, специфичных к индуцирующим защитную реакцию эпитопам HBsAg

являются подходящими. Используют соответствующее число разведений испытуемой вакцины и препарата сравнения. Полученные данные, которые могут быть подвергнуты преобразованию, анализируют методом параллельных линий. Наборы для оценки HBsAg in vitro являются коммерчески доступными, и возможна

адаптация методов их использования для определения активности in vitro.

Критерии приемлемости для данного препарата сравнения подлежат

утверждению компетентными органами с учетом данных валидации.

2.7.16. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАКЦИНЫ КОКЛЮША (БЕСКЛЕТОЧНОЙ)

Способность вакцины вызывать образование специфических антител

сравнивают с аналогичным свойством параллельно испытываемого препарата сравнения; антитела определяют с использованием подходящего

иммунохимического метода (2.7.1), например, твердофазного иммуноферментного

анализа (ELISA). В приведенном ниже описании испытания на мышах используется трехточечная модель, однако, после валидации, для рутинных испытаний может

быть использован метод однократного разведения.

Вакцина сравнения. В качестве вакцины сравнения используют партию вакцины, эффективность которой показана клиническими испытаниями, или репрезентативную партию этой вакцины. Для приготовления репрезентативной

партии необходимо строгое соблюдение технологического процесса при производстве партии, подвергающейся клиническим испытаниям. Стабильность вакцины сравнения должна быть документально подтверждена.

Требования. Способность вакцины вызывать образование антител не должна

быть существенно ниже (Р = 0,95) по сравнению с аналогичным свойством препарата сравнения.

Следующая модель испытания приводится в качестве примера метода,

пригодность которого для данного испытания подтверждена.

Отбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют здоровых мышей (например, линии CD1) из одной партии возрастом от 4 до 8

недель. Животных распределяют по шести группам, состоящим из количества особей, достаточного для выполнения требований испытания. Используют три

разведения испытуемой вакцины и три разведения препарата сравнения и назначают каждой из групп одно из разведений. Каждому животному

внутрибрюшинно или подкожно вводят по 0,5 мл разведения, которое было назначено группе, к которой данное животное относится.

Отбор образцов сыворотки. Через 4–5 недель после вакцинации проводят забор крови у мышей под анестезией. Сыворотки до определения содержания антител хранят при –200С.

Определение антител. Выполняют количественное определение содержания

специфических в отношении каждого из компонентов антител в сыворотках с

использованием метода с подтвержденной достоверностью, например, ELISA,

методика которого приведена ниже.

Испытание ELISA. Титрационные микропланшеты, выполненные из

поливинилхлорида или полистирола, в соответствии с требованиями специфического антигена, покрывают очищенным антигеном в концентрации 100 нг

на одну ячейку. После промывки непрореагировавшие участки блокируют путем

инкубации с раствором бычьего сывороточного альбумина и последующей промывки. Производят на планшетах двукратные разведения сывороток мышей, иммунизированных испытуемой вакциной и вакциной сравнения. После инкубации

при 22–250С в течение 1 часа планшеты промывают. После промывки добавляют хромогенный субстрат, высвобождающий под воздействием присоединенного

ферментного конъюгата хромофор, который может быть количественно определен путем измерения оптической плотности (2.2.25). Выбирают такие условия

испытания, чтобы в рабочем диапазоне измерений имелась линейная зависимость оптической плотности от содержания антител, а значения оптической плотности

находились в пределах от 0,1 до 2,0.

В испытании используется контрольная антисыворотка установленной активности, служащая основанием для вычисления содержания антител в испытуемой сыворотке. Также в испытании используется стандартизированная контрольная сыворотка.

Результаты испытания являются недостоверными, если:

-значение, определенное для контрольной сыворотки, отличается от приписанной

величины более чем на удвоенное значение стандартного отклонения,

-доверительный интервал оценочного значения активности шире, чем от 50 до

200%.

Вычисления. Вычисляют титры антител в сыворотках мышей, иммунизированных испытуемой вакциной и препаратом сравнения, и из полученных значений с

использованием обычных статистических методов определяют активность испытуемой вакцины относительно вакцины сравнения.

2.7.17. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТРОМБИНА III ЧЕЛОВЕКА

Содержание антитромбина III в испытуемом препарате определяют путем

сравнения его способности к инактивации тромбина в присутствии избыточного количества гепарина с такой же способностью препарата сравнения антитромбина III человека, калиброванного в Международных Единицах. Различные количества

испытуемого препарата смешивают с определенным количеством тромбина и определяют активность остаточного количества тромбина с использованием

подходящего хромогенного субстрата.

За Международную Единицу принимают активность установленного

количества Международного Стандарта концентрата антитромбина III человека.

Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Методика определения. Готовят два независимых ряда из трех или четырех разведений испытуемого препарата и препарата сравнения в диапазоне от 1/75 до 1/200 исходя из концентрации 1 МЕ/мл с использованием буферного раствора trisEDTA BSA рН 8,4 R, содержащего 15 МЕ гепарина в миллилитре.

По 200 мкл каждого из разбавлений выдерживают при 370С в течение 1–2

минут. К каждому разведению добавляют по 200 мкл раствора бычьего тромбина R

с содержанием 2 МЕ/мл в буферном растворе tris-EDTA BSA рН 8,4 R,

перемешивают и выдерживают при 370С в течение в точности 1 минуты. Добавляют 500 мкл подходящего хромогенного субстрата (например, D-фенилаланил-L-

пипеколил-L-аргинина 4-нитроанилида, растворенного в воде R с получением раствора, содержащего 4 ммоль/л и дополнительно разбавленного до концентрации,

подходящей для проведения количественного определения с использованием буферного раствора tris-EDTA BSA рН 8,4 R без добавления альбумина). Тотчас же

начинают фиксировать изменение оптической плотности при длине волны 405 нм (2.2.25), и продолжают измерение в течение не менее 30 секунд. Вычисляют скорость изменения оптической плотности ( А/мин). (Определение также может

производиться методом конечной точки путем прерывания реакции добавлением

уксусной кислоты и измерением оптической плотности при длине волны 405 нм.)

Скорость изменения оптической плотности ( А/мин) обратно пропорциональна активности антитромбина III.

Проверяют достоверность определения и вычисляют активность испытуемого препарата с использованием обычных статистических методов (например, 5.3.

Статистический анализ результатов биологических испытаний и

количественных определений).

2.7.18. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ II

Количественное определение фактора свертывания крови II производят по его специфической активации с образованием фактора IIa. Фактор IIa оценивают на

основании сопоставления его активности по расщеплению специфического хромогенного пептидного субстрата с такой же активностью Международного Стандарта или препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах.

За Международную Единицу принимают активность фактора II в

установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенного

из замороженного состояния концентрата человеческого фактора свертывания крови

II. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах

устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Хромогенный метод количественного определения включает две последовательные стадии: индуцируемая змеиным ядом активация фактора II и

ферментативное расщепление хромогенного субстрата фактором IIа с образованием хромофора, который определяют спектрофотометрически. В

соответствующих условиях испытания существует линейная зависимость между активностью фактора IIа и расщеплением хромогенного субстрата.

РЕАГЕНТЫ

Специфический активатор фактора II из яда эфы (Экарин). Белок,

получаемый из яда эфы (Echis carinatus), специфически активирующий фактор II. Восстанавливают в соответствии с инструкциями производителя. Восстановленный

препарат хранят при 40С и используют в течение 1 месяца.

Хромогенный субстрат фактора IIa. Специфический хромогенный субстрат для фактора IIa, например: Н-D-фенилаланил-L-пипеколил-L-аргинина 4-

нитроанилида дигидрохлорид, 4-толуолсульфонил-глицил-пролил-L-аргинина 4-

нитроанилид, Н-D-циклогексилглицил-α-аминобутирил-L-аргинина 4-нитроанилид, D-

циклогексилглицил-L-аланил-L-аргинина 4-нитроанилида диацетат. Восстанавливают в соответствии с инструкциями изготовителя.

Буфер для разведений. Раствор, содержащий 6,06 г/л трис-(гидроксиметил)- аминометана R, 17,53 г/л натрия хлорида R, 2,79 г/л (этилендинитрило)- тетрауксусной кислоты R и 1 г/л бычьего альбумина R или человеческого

альбумина R. При необходимости доводят значение рН до 8,4 с использованием

хлористоводородной кислоты R.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Испытуемый раствор. Испытуемый препарат разбавляют буфером для разведений, получая раствор с содержанием 0,015 МЕ фактора II в миллилитре.

Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера.

Раствор сравнения. Препарат сравнения разбавляют буфером для разведений, получая раствор с содержанием 0,015 МЕ фактора II в миллилитре.

Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера. Все растворы перед испытанием нагревают на водяной бане до 370С.

Нижеописанные условия определения относятся к титрационным

микропланшетам. Если определение производят в пробирках, объемы могут

изменяться при условии неизменности соотношений компонентов в смесях.

Определение выполняют с использованием титрационного микропланшета, поддерживаемого при 370С. По 25 мкл каждого из разведений испытуемого раствора или раствора сравнения вносят в каждый из рядов ячеек. К содержимому каждой ячейки добавляют 125 мкл буфера для разведений, затем 25 мкл экарина и инкубируют в точности 2 минуты. К содержимому каждой ячейки добавляют 25 мкл

хромогенного субстрата фактора IIa.

Регистрируют скорость изменения оптической плотности (2.2.25) при длине волны 405 нм непрерывно в течение 3 минут и получают среднюю скорость изменения оптической плотности ( А/мин). При невозможности непрерывной регистрации, оптическую плотность при 405 нм регистрируют с подходящими

последовательными интервалами, например, продолжительностью 40 секунд,

строят на миллиметровой бумаге график зависимости оптической плотности от времени и вычисляют из уклона полученной прямой значение А/мин. Из значений

А/мин для каждого разведения испытуемого препарата и препарата сравнения

вычисляют активность испытуемого препарата и проверяют достоверность

определения с использованием обычных статистических методов (5.3).

2.7.19. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ Х

Количественное определение фактора свертывания крови Х производят по

его специфической активации с образованием фактора Хa. Фактор Хa оценивают на

основании его активности по расщеплению специфического хромогенного пептидного субстрата с такой же активностью Международного Стандарта или препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах.

За Международную Единицу принимают активность фактора Х в

установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенного

из замороженного состояния концентрата человеческого фактора свертывания крови

Х. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Хромогенный метод количественного определения включает две последовательные стадии: индуцируемая змеиным ядом активация фактора Х и

ферментативное расщепление хромогенного субстрата фактором Ха с образованием хромофора, который определяют спектрофотометрически. В

соответствующих условиях испытания существует линейная зависимость между активностью фактора Ха и расщеплением хромогенного субстрата.

РЕАГЕНТЫ

Специфический активатор фактора Х из яда цепочной гадюки (RVV). Белок,

полученный из яда цепочной гадюки (Vipera russelli), который специфически активирует фактор Х. Восстанавливают в соответствии с инструкциями

производителя. Восстановленный препарат хранят при 40С и используют в течение 1 месяца.

Хромогенный субстрат фактора Хa. Специфический хромогенный субстрат

для фактора Хa, например: N-α-бензилоксикарбонил-D-аргинил-L-глицил-L-аргинина

4-нитроанилида дигидрохлорид, N-бензоил-L-изолейцил-L-глутамил-глицил-L-

аргинина 4-нитроанилида гидрохлорид, метансульфонил-D-лейцил-глицил-L- аргинина 4-нитроанилид, метоксикарбонил-D-циклогексилаланил-глицил-L-аргинина 4-нитроанилида ацетат. Восстанавливают в соответствии с инструкциями изготовителя.

Буфер для разведений. Раствор, содержащий 3,7 г/л трис-(гидроксиметил)- аминометана R, 2,1 г/л имидазола R, 0,02 г/л гексадиметрина бромида R и 1 г/л

бычьего альбумина R или человеческого альбумина R. При необходимости доводят

значение рН до 8,4 с использованием хлористоводородной кислоты R.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Испытуемый раствор. Испытуемый препарат разбавляют буфером для

разведений, получая раствор с содержанием 0,18 МЕ фактора Х в миллилитре. Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера.

Раствор сравнения. Препарат сравнения разбавляют буфером для разведений, получая раствор с содержанием 0,18 МЕ фактора Х в миллилитре. Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера.

Все растворы перед испытанием быстро нагревают на водяной бане до 370С.

Нижеописанные условия определения относятся к титрационным

микропланшетам. Если определение производят в пробирках, объемы могут изменяться при условии неизменности соотношений компонентов в смесях.

Определение выполняют с использованием титрационного микропланшета, поддерживаемого при 370С. По 12,5 мкл каждого из разведений испытуемого

раствора или раствора сравнения вносят в каждый из рядов ячеек. К содержимому каждой ячейки добавляют 25 мкл RVV и инкубируют в точности 90 секунд. К содержимому каждой ячейки добавляют 150 мкл хромогенного субстрата фактора Хa, разбавленного в соотношении 1:6 буфером для разведений.

Регистрируют скорость изменения оптической плотности (2.2.25) при длине волны 405 нм непрерывно в течение 3 минут и получают среднюю скорость

изменения оптической плотности ( А/мин). При невозможности непрерывной

регистрации, оптическую плотность при 405 нм регистрируют с подходящими последовательными интервалами, например, продолжительностью 40 секунд,

строят на миллиметровой бумаге график зависимости оптической плотности от времени и вычисляют из уклона полученной прямой значение А/мин. Из значений

А/мин для каждого разведения испытуемого препарата и препарата сравнения

вычисляют активность испытуемого препарата и проверяют достоверность

определения с использованием обычных статистических методов (5.3).

2.7.20. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПОЛИОМИЕЛИТА IN VIVO

Способность вакцины вызывать образование нейтрализующих антител определяют in vivo по одному из следующих методов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЦЫПЛЯТ ИЛИ МОРСКИХ СВИНОК

Готовят подходящий ряд, состоящий не менее чем из трех разведений

испытуемой вакцины с использованием подходящего буферизированного раствора

хлорида натрия. Морских свинок массой тела 250–350 г или цыплят возрастом 3

недели распределяют по группам, состоящим из 10 особей, и назначают каждой из групп одно из разведений вакцины. Каждому животному внутримышечно вводят по 0,5 мл разведения, которое было назначено группе, к которой данное животное относится. Через 5-6 дней проводят забор крови и отделяют сыворотки. Определяют наличие в разведениях сывороток (1:4) нейтрализующих антител к каждому из человеческих полиовирусов: 1, 2 и 3. 100 CCID50 вируса смешивают с разведением сыворотки и инкубируют при 370С в течение 4,5–6 часов. Хранят при 5±30С в течение 12–18 часов. Смеси прививают клеточным культурам для определения присутствия

вирусов, не подвергшихся нейтрализации, и ведут регистрацию результатов в

течение периода до 7 дней после инокуляции. Для каждой группы животных отмечают количество сывороток, в которых обнаружено наличие нейтрализующих

антител, и вычисляют разведение вакцины, дающее такой отклик у 50% животных.

Параллельно выполняют контрольный опыт с использованием подходящего препарата сравнения. Вакцина выдерживает испытание, если обнаруживается наличие нейтрализующих антител к каждому из трех типов вируса у 50% животных в

разведении вакцины в соотношении 1:100 или более. ИСПЫТАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КРЫС.

Метод количественного определения in vivo состоит из внутримышечного

введения в задние конечности не менее трех разведений испытуемой вакцины и

вакцины сравнения с использованием для каждого разведения группы из 10 крыс подходящей линии, не содержащих патогенов. Для получения достоверных

результатов для всех серотипов часто бывает необходимо использовать четыре разведения. Количество животных в группе должно быть достаточным для получения результатов, отвечающих критериям достоверности; десяти крыс в группе

обычно достаточно, хотя достоверные результаты могут быть получены и с меньшим числом животных в группе. Масса тела животного не должна отличаться

более, чем на 10% от средней по группе. Каждой крысе вводят по 0,5 мл материала. Диапазон доз выбирают таким образом, чтобы получить дозовый отклик для всех

трех типов полиовируса. Забор крови у животных производят через 20–22 дня.