2006_-Byelorussian_Pharmacopoeia_Volume_1

В. МЕТОД ТУРБИДИМЕТРИИ

Подходящую питательную среду с суспензией выбранного микроорганизма, обладающего чувствительностью к тестируемому антибиотику, инокулируют таким

образом, чтобы в условиях определения происходило достаточно значительное ингибирование микробного роста. Количество суспензии выбирают таким образом,

чтобы получить после четырех часов инкубации помутнение, легко подвергающееся

количественной оценке.

Инокулированную среду используют немедленно после ее приготовления.

Используя растворитель и буферный раствор, указанные в Таблице 2.7.2.-2, готовят растворы стандартного образца и испытуемого антибиотика, имеющие

известные концентрации и предположительно равные активности. Для оценки

достоверности количественного определения используют не менее трех доз стандартного образца и трех доз испытуемого антибиотика. Предпочтительно

использовать ряды доз, меняющихся в геометрической прогрессии. Для получения

необходимой линейности может оказаться необходимым осуществить выбор из

большого количества трех последовательных доз, используя соответствующие дозы для стандартного образца и испытуемого антибиотика.

Помещают равные объемы каждого из растворов в идентичные пробирки и добавляют в каждую пробирку равные объемы инокулированной среды (например, 1

мл раствора и 9 мл среды).

Одновременно готовят две контрольные пробирки без антибиотика,

содержащие инокулированную среду. В одну из них немедленно добавляют 0,5 мл формальдегида. Эти пробирки используют для настройки оптического прибора,

используемого для измерения роста.

Все пробирки, распределенные случайным образом, методом латинского

квадрата или рандомизированного блочного распределения, помещают в водяную баню или в другой подходящий аппарат, позволяющий быстро довести температуру

всех пробирок до соответствующей температуры инкубации и поддерживать их при

этой температуре в течение 3-4 часов, обеспечивая однородность температурного

режима и равное время инкубации.

По окончании инкубации рост микроорганизмов останавливают добавлением 0,5 мл формальдегида в каждую пробирку или тепловой обработкой и измеряют

степень мутности, используя подходящий оптический прибор. Можно использовать

метод, позволяющий измерять степень мутности в каждой пробирке по окончании одинаковых периодов инкубации.

Измеряют активность с использованием подходящих статистических методов.

Линейность преобразованной или не преобразованной зависимости реакции от дозы часто получается лишь в ограниченном промежутке. Именно в этом промежутке необходимо производить вычисление активности. Для подтверждения

линейности определение проводят на трех последовательных дозах из этого

промежутка. В рутинных анализах по согласованию с компетентными органами определение может проводиться по двум значениям при условии, что линейность

подтверждена адекватным количеством экспериментов с использованием трех

значений. Однако, во всех спорных случаях должно применяться вышеописанное определение по трем значениям.

В каждом определении используют достаточное для получения требуемой

точности количество репликаций. Определение может быть проведено повторно, и

результаты статистически комбинированы для получения требуемой точности и для

подтверждения того, что активность испытуемого антибиотика не менее минимальных требований.

Таблица 2.7.2.-2

Количественное определение методом турбидиметрическим методом.

Следующий раздел дается для информационных и методических целей; он не является обязательной частью общего метода.

РЕКОМЕНДУЕМЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

В нижеследующем тексте приводятся рекомендуемые микроорганизмы и

условия их применения. Могут также использоваться и другие микроорганизмы при условии, что показана их чувствительность к испытуемому антибиотику и они могут

использоваться в подходящей среде и при подходящих значениях температуры и

рН. Концентрации используемых растворов должны быть выбраны таким образом,

чтобы в условиях испытания обеспечивалось наличие линейной зависимости между логарифмом дозы и реакцией.

Приготовление посевного материала:

Bacillus cereus var. mycoides; Bacillus subtilis; Bacillus pumilus. Суспензия спор

микроорганизмов, используемая в качестве посевного материала, готовится следующим образом.

Микроорганизм выращивается при 35-37°С в течение 7 дней на поверхности подходящей среды, к которой добавлен сульфат марганца (II) в концентрации 0,001 г/л. Выращенную культуру, состоящую в основном из спор, смывают стерильной водой. Нагревают суспензию при 70 °С 30 минут и разбавляют для получения подходящей концентрации спор, обычно от 10 х 106 до 100 х 106 в мл. Суспензия спор может храниться в течение продолжительного времени при температуре, не превышающей 4°С.

Суспензия спор также может быть приготовлена путем культивирования

организмов в среде С при 26°С в течение 4-6 дней с последующим добавлением в асептических условиях сульфата марганца в количестве, достаточном для получения концентрации 0,001 г/л и инкубированием в течение 48 часов. Суспензию

микроскопируют для подтверждения спорообразования (около 80%) и

центрифугируют. Осадок ресуспендируют в стерильной воде, получая концентрацию спор от 10 х 106 до 100 х 106 в миллилитре, после чего нагревают при 70°С в течение 30 минут. Суспензию хранят при температуре, не превышающей 4°С.

Bordetella bronchiseptica. Микрорганизм выращивают на среде В при 35-37°С в течение 16-18 ч. Выращенную культуру смывают стерильной водой и разбавляют до

требуемой степени мутности.

Staphylococcus aureus; Klebsiella pneumoniae; Escherichia coli; Micrococcus flavus; Staphylococcus epidermidis. Посевной материал готовят по методу,

описанному выше для В. bronchiseptica, но с использованием среды А и доведением степени мутности до значения, дающего, в зависимости от метода,

удовлетворительную зависимость реакции от дозы в турбидиметрическом определении или четкие зоны ингибирования подходящего диаметра.

Saccharomyces cerevisiae; Candida tropicalis. Тест-культуры выращивают на среде F при 30-37°С 24 часа. Смывают выращенную культуру стерильным раствором натрия хлорида с концентрацией 9 г/л. Разбавляют до требуемой степени мутности тем же раствором.

# Допустимо использование следующих методов приготовления посевного материала:

Candida utilis ЛИА-01

Выращивают в пробирках со скошенной средой № 3 в течение 48 часов при

температуре (30 ± 1)°С.

Staphylococcus aureus

Выращивают в пробирках со скошенной средой № 1 в течение 24 часов при

температуре (36 ± 1)°С.

Bordetella bronchiseptica

Выращивают в пробирках со скошенной средой № 1. Продолжительность

инкубации 30-36 часов при температуре (36 ± 1)°С.

Pseudomonas aeruginosa NCTC 2134

Выращивают на мясо-пептонном бульоне рН 7,2-7,4 при температуре (36 ± 1)°С в течение 18-20 часов.

Bacillus pumilus, NCTC 8241, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus cereus var.mycoides

HB, Bacillus cereus var.mycoides 537

Для получения суспензии спор тест-микроорганизмы выращивают на

скошенной среде в пробирках (среда № 1 для В. subtilis var.L2, B.pumilus NCTC8241,

В. subtilis ATCC 6633, B.cereus var.mycoides HB; среда № 2 для B.cereus var.mycoides

537), при температуре (36 ± 1)°C 18-20 часов. Культуру, выращенную в пробирках, смывают 5-10 мл стерильного раствора натрия хлорида 0,9 %, засевают ею

несколько матрацев с 300 мл питательной среды со скошенной поверхностью, (среда № 4 для B.pumilus, В. cereus var.mycoides 537; среда № 5 для В. subtilis ATCC

6633, B.cereus var.mycoides HB). На матрацах посевы инкубируют при температуре (36 ± 1)°С в течение 5-7 суток. В процессе выращивания проводят микроскопический

контроль культуры. Культуру, содержащую 80-90 % спор, смывают стерильной дистиллированной водой.

Полученную взвесь спор прогревают при температуре от 60 до 70°С в течение 30 минут. Затем промывают стерильной дистиллированной водой при центрифугировании до полной прозрачности надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор вновь прогревают в течение 30 минут при температуре от 60 до 70°С.

Взвесь спор хранят при температуре от 4 до 10°С и используют до тех пор, пока

интенсивность роста и четкость зон при определении антимикробной активности

препаратов удовлетворяют предъявляемым требованиям.

Таблица 2.7.2 - 3

Характеристики культуральных свойств тест-микроорганизмов.

Буферные растворы. Буферные растворы с показателем рН в интервале от 5,8 до 8,0 готовят смешиванием 50,0 мл 0,2 М раствора калия фосфата однозамещенного с указанным в Таблице 2.7.2.-4 объемом 0,2 М раствора натрия

гидроксида. Разбавляют свежеприготовленной дистиллированной водой до 200,0 мл.

Эти буферные растворы используются для всех микробиологических определений, указанных в Таблице 2.7.2.-1, за исключением блеомицина сульфата и амфотерицина В.

Буферный раствор (рН 6,8) для блеомицина сульфата готовят растворением

6,4 г калия фосфата однозамещенного и 18,9 г натрия фосфата двузамещенного в воде и доведением объема до 1000 мл.

# Допускается также применение буферных растворов следующего состава:

Буферные растворы стерилизуют насыщенным паром под давлением при 121°С 15 минут.

Питательные среды. Могут быть использованы следующие или