3. Применение хроматографических методов для контроля качества водорастворимых витаминов

3.1. Использование хроматографических методов для идентификации

3.1.1 Применение тонкослойной хроматографии

Различные витамины группы В и витамин С можно разделить методом одномерной хроматографии на слое силикагеля Г с 2% флуоресцирующего индикатора «ZS-cynep», приготовленном по методу Шталя. Наилучшие результаты получены со смесью растворителей ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5: 5:20: 70). Метод был разработан для комбинаций витаминов, имеющихся в фармацевтике. Для точного определения всех компонентов необходимо из каждой пробы нанести на пластинку по два пятна. Высушенные хроматограммы (длина пути 19 см) рассматривают в длинноволновом УФ-свете, где рибофлавин можно определить по желтой флуоресценции на темном фоне. В коротковолновом УФ-свете можно обнаружить витамин B1, витамин С и амид никотиновой кислоты в виде темных пятен, витамин B2 — в виде желтоватого, а витамин B6 — в виде темно-синего пятна на светлом флуоресцирующем слое. Для идентификации биотина одну хроматограмму закрывают, а другую обрабатывают иодо-платинатом, причем биотин обнаруживается в виде белого пятна на розовом фоне. При этом витамин B1 окрашивается в серый цвет, амид никотиновой кислоты — в светло-желтый и витамин С — в желтый [11].

3.1.2 Определение водорастворимых витаминов в биологически-активных веществах и фармацевтических препаратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Один из самых популярных методов определения хроматографии является высокоэффективная жидкостная хроматография, благодаря возможности одновременного определения сразу нескольких соединений [12]. Для определения оптимальных условий определения витаминов необходимо изучить влияние на их удерживание хроматографических параметров. Наиболее значительно на удерживание соединений влияют природа неподвижной фазы, рН подвижной фазы, содержание ацетонитрила в элюенте. Поскольку многие витамины по своей природе являются кислотами или основаниями, большое влияние на их удерживание оказывает рН элюента. Одно из основных условий для достижения наиболее эффективного разделения веществ - выбороптимального градиентного режима. Используя различные градиентные профили, можно добиться хорошего разрешения хроматографических пиков веществ, имеющие близкие значения времени удерживания, а также существенно снизить общее время проведения анализа. Выбор и поддержание оптимальной температуры колонки важно для успешного разделения и определения анализируемых веществ. Оптимальными условиями для разделения витаминов являются: элюент а – 0,6% фосфорная кислота, элюент b – ацетонитрил, температура колонки 20ºС.Представлена хроматограмма модельной смеси витаминов в выбранных условиях (рисунок 13):

Витамины: 1 – пиридоксамин; 2 - тиамин; 3 –никотинамид; 4 – никотиновая кислота; 5 - аскорбиновая кислота; 6 – пиридоксаль; 7 – пиридоксин; 8 –пантотеновая кислота; 9 – фолиевая кислота; 10 – цианокоболамин; 11 – рибофлавин; 12 – биотин

Рисунок 13 – Хроматограмма стандартного раствора витаминов

Были проведены анализы медицинского витаминного препарата «Ундевит», БАД «Алфавит», витаминного премикса «GS-vit 12». Для извлечения витаминов из исследуемых объектов использовали 1%- й раствор фосфорной кислоты (рН 1,5). Экстракцию витаминов из исследуемых объектов проводили в ультразвуковой бане. Точную навеску анализируемого образца помещали в стеклянную колбу вместимостью 250,0 мл, заливали экстрагентом и помещали в ультразвуковую ванну. Величину навески препарата рассчитывали таким образом, что бы получившиеся концентрации для всех определяемых витаминов попадали в диапазон всех определяемых концентраций. Для проведения анализа в форме таблеток отобрали 15 – 20 штук, взвесили и тщательно растерты в фарфоровой ступке. Расчеты содержания витаминов проводилось по отношению к массе, эквивалентной одной таблетке. Данные по полученным результатам хорошо согласуются с паспортными данными. Приведена хроматограмма экстракта драже «Ундевит» (рисунок 14) [13]:

Витамины: 1 – тиамин; 2 – никотиновая кислота; 3 – аскорбиновая кислота; 4 – пиридоксин; 5 – пантотеновая кислота; 6 – фолиевая кислота; 7 – рибофлавин

Рисунок 14 - Хроматограмма экстракта дражже «Ундевит»