вирусология шпоры / Культуры клеток многоклеточных организмов. Первично-трипсинизированные, перевариваемые и диплоидные
..docРазновидностью суспензионного культивирования является культи-
вирование на микроносителях - клетки размножаются в прикрепленном наповерхности мельчайших полимерных частиц состоянии, которые сами находятся во взвешенном состоянии. Для культивирования клеток в виде монослоя пригодны к использованию пробирки в наклоненном положении, либо же специальные матрасы различной площади (от 25 см2 до 150 см2).
Культивирование в суспензионном состоянии проводят в специаль-
ных аппаратах, называемых биореакторами, и только тех типов культур, которые обладают способностью размножаться во взвешенном состоянии. Существуют биореакторы нескольких типов, отличающихся по принципу работы – биореакторы с механическим механизмом перемешивания, газо-вихревые биореакторы, в которых перемешивание осуществляется за счет воздушного потока, подаваемого через среду, а также комбинированные биореакторы. Рабочий объем названных биореакторов может быть самым разным - от 2 до 28 000 л и даже больше. В зависимости от морфологии культивируемых клеток различают две основные разновидности культур клеток: эпителиоподобные и фибробластоподобные. Клетки первой разновидности характеризуются округлой формой, плотно прилегают друг к другу, формируя слой с очень маленьким количеством межклеточного пространства. Фибробластоподобные клетки представляют собой веретенообразные фибробласты, образуют волокна. Кроме того, существует еще один морфологический тип культур клеток – лейкоцитарная культура, представляющая собой размножающиеся in vitro лейкоциты.
1. Первичные культуры клеток – это культуры клетки, полученные непосредственно из живого организма. Их готовят только перед применением, так как для длительного культивирования они не пригодны. Можно получить первичную культуру из различных органов и тканей человека и животных, однако лучше это удается сделать из эмбриональных органов. Чаще всего используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных. После соответствующей подготовки их измельчают на кусочки размером 1-2 мм и обрабатывают трипсином (такие культуры
называют первично-трипсинизированными или просто первичными). Затем полученную взвесь клеток разливают по пробиркам или в другую посуду, заливают питательной средой, инкубируют в термостате и получают монослой клеток. Обычно он формируется через 3 - 5 дней. Скорость формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов. Питательную среду меняют по мере ее загрязнения продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7 -21 дня. Из первичных клеток можно получить субкультуры путем снятия их со стекла раствором версена (или смесью версена и трипсина) и ресуспендирования в новой питательной среде. При этом процесс переноса клеток из одной системы в другую называется пассажем. Субкультуры сохраняются в пределах 2-5 пассажей и очень редко до 8-10. Последующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели.Первичные культуры полностью сохраняют генотип и фенотип исходных клеток, поэтому дают основание достоверно судить о характере взаимодействия вируса с клеткой. Тем не менее, использование первичных культур клеток имеет свои ограничения –ее недолговечность и большая вероятность контаминации другими вирусами. Первичные культуры клеток чаще культивируют в виде монослоя или на микроносителях.
2. Перевиваемые культуры клеток - это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой при условии замены питательной среды. Предполагается, что перевиваемой может считаться стабильная культура, которая пассировалась не менее 70 раз с 3-х дневными промежутками.
Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Эта работа проводится в течение многих месяцев. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых клеток — результат их генетической изменчивости.
Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных культур он диплоидный), стабильны в условиях роста в пробирке, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство ограничивает их использование при производстве вакцин. Перевиваемые клетки можно получить из здоровых и опухолевых
тканей как животных, так и человека. Примеры перевиваемых культур клеток: ВНК-21 (baby hamster kidney; почка новорожденного хомячка); ППТ (перевиваемая почка теленка); ППО (перевиваемая почка овцы); Нер-2 (карцинома гортани человека); Hep -3 (лимфоидная карцинома человека) и др.
3. Диплоидные культуры клеток представляют собой линии, в оторых 75% клеток имеют кариотип, идентичный таковым клеток, из которой она выведена. По сути дела диплоидные культуры представляют собой перевиваемые культуры, но только с двойным (правильным) набором хромосом. В первых 50-60 пассажах такие культуры остаются диплоидными и их широко используют для решения ряда теоретических и практических задач биологии (приготовление биопрепаратов для человека, выделение онковирусов и др.). Они весьма жизнеспособны, не подвержены морфологическим изменениям, свободны от спонтанного вирусоносительства и т.д.