БХлабы / Определение общего билирубина

Определение концентрации общего билирубина в сыворотке крови

Принцип метода: В кислой среде в присутствии диазотированного 2,4-дихлоранилина билирубин образует азосоединение красного цвета. Специфическая смесь детергентов делает возмодным надежное и точное определение общего билирубина.

Интенсивность окраски раствора при длине волны 540-560 нм прямо пропорциональна концентрации билирубина в нем.

Линейность метода: 1,7 - 513 мкмоль/л.

Норма:

Сыворотка крови – 1,7-21 мкмоль/л (25-37С).

Концентрация общего билирубина сохраняется стабильной, при условии непопадании солнечного света на образцы, в сыворотке/ гепаринизированной или ЭДТА-плазме в течение 1 дня при комнатной температуре, при температуре хранения 2-8С – в течение 7 дней, при температуре –20С – в течение 3 месяцев.

Оборудование и реагенты:

1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 540-560 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 25-37С;

2. Секундомер;

3. Автоматические пипетки на 25 мкл, 250 мкл и 1000 мкл;

4. Сыворотка крови/ гепаринизированная или ЭДТА-плазма;

5. Реагент 1 (детергент в ТРИС-буфере, рН 8,2 8 ммоль/л);

6. Реагент 2 (соляная кислота 30 ммоль/л, 2,4-дихлорфенол 1 ммоль/л, детергент, диазониевая соль);

7. Стандарт (раствор билирубина мкмоль/л);

8. Дистиллированная вода.

Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Образец (например, сыворотка)	25 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	25 мкл
3. Дистиллиро-ванная вода	--	25 мкл	--
4. Реагент 1.	1 мл	1 мл	1 мл
Перемешать содержимое пробирок, инкубировать 5 мин при 37С, или 10 мин при 20-25С. Измерить оптическую плотность А1 против холостой пробы при длине волны 540-560 нм.
5. Реагент 2	250 мкл	250 мкл	250 мкл

Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре или 5 мин при температуре 37С. Измерить оптическую плотность А₂ опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 540-560 нм. Вычислить А = А2 – А1 для образца и стандарта.

Расчет

Расчет по стандарту концентрации общего билирубина в сыворотке крови проводят по формуле:

Аоп С (мкмоль/л) = -----------  Сст, Аст

где А – разность оптических плотностей А₁ и А₂;

С_ст – концентрация стандарта (мкмоль/л).

Если концентрация общего билирубина превышает 513 мкмоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Клинико-диагностическое значение: Билирубин – это продукт распада гемоглобина. Свободный (неконъюгированный) билирубин совершенно неполярен и почти нерастворим в воде, поэтому для транспортирования его в крови от селезенки к печени образуется комплекс с альбумином. В печени билирубин конъюгирует с глюкуроновой кислотой, а образующийся комплекс билирубин–глюкуроновая кислота (связанный билирубин) экскретируется в желчные протоки.

Гипербилирубинемия может бить вызвана увеличенным образованием свободного билирубина в результате гемолиза (гемолитическая/ прегепатитная желтуха), повреждения паренхимы печени (паренхиматозная/ интрагепатитная желтуха) или закупорки желчных протоков (обтурационная/ постгепатитная желтуха).

Хроническая врожденная гипербилирубинемия (преобладание свободного билирубина) называется синдромом Гилберта и встречается довольно часто.

Высокие уровни билирубина наблюдаются у 60-70% новорожденных из-за усиленного послеродового разрушения эритроцитов и отставания в активности ферментов деградации билирубина.

Общепринятые методы анализа определяют либо общий, либо прямой билирубин. Прямой билирубин – это конъюгированный, растворимый в воде билирубин. Следовательно, неконъюгированный (свободный) билирубин может быть оценен как разница между общим и прямым билирубином.