Применение пцр

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.

Криминалистика

Самым уникальным является определение генотипа . Существует два основных типа такого анализа - снятие отпечатков ДНК и ПЦР.

ПЦР используется, когда количество ДНК недостаточно или ДНК слишком разрушена для снятия отпечатков ДНК. К тому же снятие отпечатков ДНК требует относительно длинных нитей ДНК. ПЦР наиболее полезна для участков ДНК с высокой индивидуальной изменчивостью: если два образца совпадают в нескольких зонах с высокой изменчивостью, то они, вероятно, принадлежат одному и тому же человеку.

ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью электрофореза ДНК. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (англ.genetic fingerprint).

Установление отцовства

Рис. 3: Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. (1) Отец. (2) Ребенок. (3) Мать. Ребенок унаследовал некоторые особенности генетического отпечатка обоих родителей, что дало новый, уникальный отпечаток.

Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключением случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков (рис. 3). Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционногородства среди организмов.

Медицинская диагностика

ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусныхзаболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют (определяют последовательность его нуклеотидов) для определениямутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятсясимптомызаболевания.

Результат ПЦР-диагностики обычно готов через 1,5-2 суток после забора материала

ПЦР имеет неоценимое значение в диагностике ИППП, генитального кандидоза, вирусного гепатита, туберкулеза.

Персонализированная медицина

Иногда лекарства оказываются токсичными или аллергенными для некоторых пациентов. Причины этого — отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизмелекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенныйцитохром(белок печени, отвечающий за метаболизм чужеродных веществ) может быть более активен, у другого — менее. Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства.Такой анализ называют предварительнымгенотипированием(англ.prospective genotyping).

Клонирование генов

Клонирование генов(не путать склонированиеморганизмов) — это процесс выделения генов и, в результатегенноинженерных манипуляций, получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется ввектор — фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмидыили вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена — РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др.

Рис. 4: Клонирование гена с использованием плазмиды. . (1) Хромосомная ДНК организма A. (2) ПЦР. (3) Множество копий гена организма А. (4) Вставка гена в плазмиду. (5) Плазмида с геном организма А. (6) Введение плазмиды в организм В. (7) Умножение количества копий гена организма А в организме В.

Секвенирование ДНК

В методе секвенирования с использованием меченых флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопомдидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченые флуоресцентной или радиоактивной меткой. Это останавливает реакцию, позволяя определить положения специфических нуклеотидов после разделения синтезированных цепочек в геле.

Мутагенез

В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза (внесения изменений в нуклеотидную последовательность ДНК). Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.

Ссылки

1. ↑ Kleppe, K. et al. (1971): Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases. In: J. Mol. Biol. Bd. 56, S. 341—361. PMID 4927950

2. ↑ Нобелевские лауреаты по химии, 1993 г.(англ.)

3. ↑ R. K. Saiki, D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, H. A. Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. in: Science. 239.1988, 487—491. ISSN0036-8075PMID: 2448875

4. ↑ Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. // Биохимия.- 1980.- T. 45.- C. 644—651.

5. ↑ http://www.roche.com/med-cor-2005-09-12

6. ↑ 1 kbp (kilo base pair(англ.)) — 1 тысяча пар оснований, единица измерения длины ДНК

7. ↑ Venter J, et al. (2001). «The sequence of the human genome». Science 291 (5507): 1304-51. PMID 11181995

8. ↑ http://www.biofidal.com/biofidal2/cat/2/pyro.php

9. ↑ Отжиг (англ.annealing) — гибридизация фрагментов ДНК

10. ↑ Шпилька — внутримолекулярная самокомплементарная структура

11. ↑ Димер — межмолекулярные структуры, образуемые праймерами друг с другом или сами с собой

12. ↑ http://www.dna-technology.ru/doc/DNA-Technology_PCR-base.pdf«Теоретические основы ПЦР» (PDF)

Литература

1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с, илл. ISBN 5-03-003328-9

2. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. — 496 с; илл. ISBN 5-94087-098-8

3. Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы — М.: Наука, 2005 — В 2 т. — ISBN 5-02-033278-X

ПЦР -ДИАГНОСТИКА

Полимеразная цепная реакция - метод лабораторного исследования, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации любого патогенного возбудителя. Метод основан на открытии американского ученого Кери Маллиса

ПЦР диагностика дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику различных вирусных заболеваний, в частности, хламидиоза, микоплазмоза, уреаплазмоза, гарднереллеза, герпеса и т.п. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся первые симптомы.

Это один из самых распространенных методов лабораторной диагностики, который позволяет благодаря многократному увеличению последовательностей ДНК выявить даже единичные клетки возбудителя.

Происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Метод ПЦР незаменим для выявления латентных и хронических инфекций, так как размножению подвергается только ДНК бактерии, а не сама бактерия. Эта особенность позволяет обнаружить бактерии и вирусы, патогенные человеку, которые невозможно увидеть в мазке или определить методом ИФА. Кроме того, с его помощью можно определить количество копий возбудителя, что очень важно при наблюдении в процессе лечения, так как это позволяет оценить качество терапии.

Высокая специфичность ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале появляется характерный только для данного вида возбудителя фрагмент ДНК.

Выявляя единичные клетки бактерий или вирусов, ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

ПРЕИМУЩЕСТВА ПЦР КАК МЕТОДА ДИАГНОСТИКИ

Одним из важнейших критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа является показатель «чувствительности». При этом следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР, представляет собой то минимальное количество копий (геномных эквивалентов-г/э) ДНК или РНК в одном миллилитре раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Большинство коммерческих амплификационных тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую НК если ее концентрация составляет не менее нескольких сот г/э копий в 1 мл образца. Например, аналитическая чувствительность большинства тест-системы для ВИЧ-1 составляет 300-500 копий ДНК в 1 мл образца. Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора и оценивается в процентах. В этом аспекте имеется общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем - диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95-98%.

Второй универсальный критерий лабораторной эффективности – «специфичность», определяется процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа. Метод ПЦР обладает высочайшей специфичностью, которая достигает 99-100%. Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосходят таковые, обеспечиваемые культуральным методом, которые являются «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний. Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущество метода ПЦР становится несомненным. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение даже нескольких недель при соблюдении соответствующих температурных норм. Проведенная недавно в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что “быстрые” или экспресс-тесты имеют чувствительность 40-60%, ИФА - 50-70%, прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) - 55-75%, культуральное исследование - 60-80%, а ПЦР от 90 до 100%.

Как видно ПЦР, по сравнению с другими способами обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и непродолжительностью по времени анализа, т.е. «актуальностью» получения результата исследования врачом и пациентом.

Таким образом, приведенные выше факты позволили отметить следующие преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики:

1. Универсальность Метод принципиально позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно. Вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов. Это обуславливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов.

2. Специфичность Высокая специфичность (100%) метода обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент НК (нуклеотидная последовательность), характерный только для данного возбудителя или гена. Таким образом, ПЦР - диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами.

3. Чувствительность Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания НК. В настоящее время реальный порог’ чувствительности коммерческих амплификационных тест-систем позволяет определять несколько сот копий в исследуемом образце.

4. Актуальность ответа (быстрота получения результата) Высокая технологичность и автоматизация метода позволяет получить результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения анализа.

5. Возможность доклинической и ретроспективной диагностики ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме ещё до развития заболевания. Например, при инфекциях в инкубационном периоде, т.е. серонегативной фазе или при латентном характере заболевания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксированном) материале или биологических остатках, что важно для идентификации личности или отцовства.

6. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.

7. Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата.

8. Возможность экспертизы Полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами.

Несмотря на вышеуказанные достоинства метод ПЦР все же не лишен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований.

Главные особенности метода ПЦР:

• 100% специфичность, т.к. каждый возбудитель имеет уникальный фрагмент нуклеиновых кислот,

• высокая чувствительность,

• возможность определить количество копий возбудителя (позволяет оценить качество терапии),

• возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей,

• быстрота получения результата и полная автоматизация.

Ключевым фактором успешности процесса, является, пожалуй, правильный выбор последовательности праймеров. Можно использовать программы, значительно упрощающие поиск подходящих регионов ДНК или даже выбирающие пару праймеров автоматически (например, "Oligo" от molecular Bioligy Insights).

Метод ПЦР служит основой для дальнейших исследований амплифицированной последовательности:

- расщепления рестриктазами;

- гибридизации с аллель-специфическими олигонуклеотидными зондами;

- определения нуклеотидной последовательности;

- исследования экспрессии in vitro с целью поиска мутаций, укорачивающих молекулу белка.