Выделение плазмидной днк модифицированным методом щелочного лизиса по Бирнбойму и Долли

Для выделения ДНК культуру клеток выращивают в 3 мл в течение 16 часов при 37^оС при интенсивной аэрации. Клетки осаждают центрифугированием на настольной центрифуге, промывают раствором "А"(50 мM Трис-HCl pH 8.0; 25 мM ЭДТА; 10%сахароза) и инкубируют в 100 мкл того же раствора в присутствии 100 мкг/мл лизоцима. Денатурацию проводят добавлением 200 мкл раствора "B", состоящего из 200 мM NаОН и 1%-ого додецилсульфата натрия в течение 1-2 мин. Pенатурацию проводят на ледяной бане в течение 15 мин добавлением 150 мкл раствора "С" (3 М ацетат калия, рН 4.8). После центрифугирования в течение 10 мин при 3000 об/мин отбирают супернатант и осаждают из него ДНК с помощью ПЭГ-8000 (Sigma) в конечной концентрации 6.5%. Осадок промывают 70%-ным этанолом, высушивают и растворяют в 100мкл воды. Очистку от примесей РНК осуществляют с помощью инкубации в течение 20 мин при 65^оС в растворе LiCl и ацетата аммония в конечных концентрациях 3 М и 2.8 М соответственно. После центрифугирования в течение 10 мин при 3000 об/мин ДНК из супернатанта осаждают равным объемом изопропанола, промывают 70% этанолом, высушивают и растворяют в воде.

Амплификация и выделение низкокопийных плазмид

Амплификация плазмиды

1. засеять на ночную инкубацию 1 колонию в 5ml среды LB с необходимым антибиотиком;

2. в 3 колбы (по 750ml) разлить по 150ml среды LB, внести по 1ml ночной культуры клеток, добавить антибиотик;

3. подращивать на качалке до D₆₀₀=1;

4. добавить в каждую колбу по 10mg хлорамфеникола и по 200µl 40% глюкозы;

5. инкубировать ночь на качалке;

Щелочное выделение ДНК

6. ЦФ 8krpm 10';

7. ресуспендировать бактерии в 10ml H₂O;

8. добавить 20ml раствора (0.2 M NaOH, 1% SDS), тщательно перемешать, 20-15' инкубации на столе;

9. добавить 15ml 3М NaA c pH 5.0, тщательно перемешать, инкубировать в холодильнике (+4^OС) 1h (можно и на ночь оставить);

10. ЦФ 12 krpm 15';

11. супернатант перелить, добавить к нему 80ml этанола, перемешать, инкубировать 30' при -20^OС;

12. ЦФ 12 krpm 10';

13. растворить в 1-2ml H₂O, разлить в 1.5ml пробирки;

14. добавить 5M LiCl в пропорции 1:1. Перемешать, инкубировать 10' при -70^OС;

15. ЦФ 12 krpm 10';

16. к супернатанту добавить двойной объём этанола, перемешать;

17. ЦФ 12 krpm 10';

18. растворить в 800µl H₂O;

19. добавить 10µl RNase A (10mg/ml);

Очистка днк на колонке

20. добавить к раствору ДНК 1g CsCl, растворить;

21. инкубировать ночь при +4^OС

22. ЦФ 12 krpm 10';

23. к супернатанту добавить краску для нанесения на форез и нанести на колонку с сефарозой СL-2B в TE буфере;

24. снимать фракции по 0.5-1ml;

25. проверить наличие ДНК во фракциях на 1% агарозе;

26. провести диализ фракций с ДНК в буфере ТЕ.

ОЧИСТКА ВЫДЕЛЕННЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Одной из самых важных процедур в молекулярном клонировании является

очистка нуклеиновых кислот. Ключевой этап – удаление белков – часто проводят с помощью экстракции водных растворов нуклеиновых кислот фенолом и (или) хлороформом. Такую экстракцию используют там, где нужно инактивировать и удалить ферменты, применяемые на одном из этапов клонирования, прежде чем перейти к следующему. Если же нуклеиновые кислоты выделяют из сложных смесей молекул, таких как клеточные лизаты, то необходимо прилагать дополнительные усилия. В таких случаях прежде чем проводить экстракцию органическими растворителями, чаще всего удаляют большинство белков гидролизом их протеолитическими ферментами, такими, как проназа или протеинкиназа К (табл.), которые активны в отношении широкого спектра нативных белков.