Физико-химические методы структурного анализа галактанов

Процедура установления строения галактанов (как и других природных полисахаридов) существенно изменилась после введения в практику спектроскопии ¹³С-ЯМР. В 1977 г. было показано, что углеродные спектры регулярных полисахаридов типа агарозы или каппа-каррагинана выглядят как спектры дисахаридов и представляют собой 12 хорошо разрешенных сигналов. При этом положение аномерного сигнала -галактопиранозы зависит от ее абсолютной конфигурации, что позволяет по спектру ¹³С-ЯМР относить неизвестный полисахарид к группе агара или каррагинана. Заместители типа О-метильных или сульфатных групп вызывают закономерные смещения сигналов ближайших атомов углерода (как правило, на 6-10 м.д. в слабое поле для атома, несущего заместитель, и на 2-4 м.д. в сильное поле для двух соседних атомов), что дает возможность локализовать такие заместители по данным спектра ¹³С-ЯМР. Вскоре были описаны и сведены в таблицу спектры ¹³С-ЯМР дисахаридных повторяющихся звеньев большинства наиболее известных галактанов красных водорослей. В результате этой работы впервые появилась возможность прямой идентификации галактанов: если из водоросли выделяли полисахарид уже известного типа, то вместо длительной процедуры его химического исследования, было достаточно сравнить его спектр ¹³С-ЯМР с литературными данными. В случае же обнаружения новых повторяющихся звеньев их строение можно было вывести из спектра ¹³С-ЯМР, зная закономерности изменения положения сигналов под действием заместителей (рис.5, d).

Спектроскопию ¹³С-ЯМР стали весьма эффективно использовать и в сочетании с химическими методами структурного анализа, например, для оценки результатов химической модификации полимеров, ферментативного гидролиза и т.д. Со временем усовершенствование разрешающей способности спектрометров привело к тому, что стало возможным получение удовлетворительных спектров ¹Н-ЯМР полисахаридов. Это позволило применять для интерпретации сигналов технику двумерной спектроскопии. Современная работа по установлению строения галактанов уже немыслима без применения спектроскопии ЯМР.

В то же время не следует думать, что этот метод решил все проблемы структурного анализа. Его главная ценность состоит в том, что по спектрам ¹³С-ЯМР можно легко отделить сравнительно простые полисахариды от более сложных, для которых одних спектральных данных недостаточно, и сосредоточить усилия по применению химических методов исследования на установлении строения последних. Хорошим примером таких сложных галактанов являются полисахариды известковых красных водорослей, так называемые «кораллинаны». Они представляют собой агараны, настолько перегруженные заместителями (О-метильными, сульфатными группами и остатками β-D-ксилопиранозы), что сигналы углеродных атомов главной цепи в спектре ¹³С-ЯМР выглядят как уширенные и плохо разрешенные пики, которые невозможно интерпретировать. Однако несколько химических модификаций (десульфатирование до и после расщепления по Смиту) и анализ спектров ЯМР модифицированных полимеров позволили разобраться в структуре этих полисахаридов.

Для структурного анализа сложных галактанов, в молекулах которых встречается несколько различных повторяющихся звеньев, сравнительно недавно предложен новый подход, заключающийся в сопоставлении спектров ¹³С-ЯМР нативного полисахарида, продукта его метилирования и продуктов десульфатирования этих двух полимеров. Следует отметить, что интерпретация спектров ¹³С-ЯМР обычно делается в предположении, что полисахариды содержат блоки, построенные из одинаковых дисахаридных звеньев. Блочное построение было действительно доказано в ряде случаев для галактанов, содержащих 2-3 типа повторяющихся звеньев, но с дальнейшим усложнением димерного состава удельный вес «переходных областей» в структуре должен неизбежно возрастать. Как выглядят спектры ¹³С-ЯМР таких переходных областей, где непосредственно соседствуют дисахаридные звенья разного строения, еще предстоит установить.

Из других физико-химических методов исследования галактанов традиционно широко используется ИК-спектроскопия. В ИК-спектрах можно видеть полосу поглощения при 1240 см^-1, общую для всех сульфатных групп, и специфические полосы поглощения первичного (820 см^-1), вторичного экваториального (830 см^-1) и вторичного аксиального (850 см^-1) сульфата. Сульфатная группа в положении С₂ остатка 3,6-ангидрогалактозы обладает собственной полосой поглощения при 810 см^-1. Исходя из этого можно использовать ИК-спектры как простой метод локализации сульфатных групп, дающий ориентировочные сведения об их количественном содержании в разных положениях молекулы полисахарида.