Подготовка у универсиаде 2012 / Генетика (Жимулев) / 8-1ver7

Глава 8. Молекулярные механизмы мутагенеза, репарации ДНК, кроссинговера и генной конверсии

8.1. Характеристики мутаций

8.1.1. Мутации, связанные с нарушением генетического кода

Мутациипредставляютсобойрешающее доказательство того, что ДНК является материалом наследственности. Когда измененияпоследовательностейнуклеотидов ДНК обуславливают изменения в последовательностях аминокислот белка, можно заключить, что ДНК кодирует этот белок.

Различают дваосновныхтипаточковых мутаций:а)заменыоснованийиб)мутациисо сдвигом рамки считывания, связанные с выпадением или вставкой одного или несколькихоснований.

Замены оснований возникают следующимипутями:чащепроисходятзамены одного пурина на другой, либо одного пиримидинанадругой.Этизаменыназывают транзициями.Возможнычетыретипатранзиций: A→ G,G→ A,T→ C,C→ T.ВрезультатеG-C паразаменяетсянаA-Tпаруилинаоборот.

Классическим примером транзиций являютсязаменынуклеотидовподдействием азотистой кислоты. Этот реагент производит окислительное дезаминирование, что превращает цитозин в урацил. В следующем послетранзициициклерепликацииДНКэтот урацилспариваетсясадениномвместогуанина, скоторымдолженбылспариватьсяисходный цитозин.ВрезультатеC-Gпаразаменяетсяна T-A пару, когда уже аденин спаривается с тимином в следующем цикле репликации. Азотистаякислотатакжедезаминируетаденин, обуславливаяобратнуютранзициюизA-TвG- Cпару.

Транзициимогутбытьтакжеобусловлены нарушениями спаривания оснований, когда

спариваютсянеобычныепартнеры.Некоторые мутагены являются аналогами нормальных оснований. Мутагенное действие этих соединений является результатом их включения в ДНК на место одного из регулярныхоснований.Напримербромоурацил (BrdU) является аналогом тимина, который содержит атом брома на месте метильной группы. BrdU включается в ДНК на место тиминаиможетспариватьсяуженесаденином, асгуанином,чтоприводиткзаменеисходной A-TпарынаG-C.

Мутациитипатранзицийиндуцируютсяс определенной долей вероятности в каждом репликационномцикле.

Болеередкимиявляютсязаменыпурина напиримидинилипиримидинанапурин.Такие замены, называемые трансверсиями, могут

этого A-T пара превращается в T-A или C-G пару.

Мутации,возникшиеврезультатезамены оснований, часто проявляют некоторые остаточные функции нормального гена, т.е. говорят, что мутация как бы «подтекает» (leaky-мутации).Этаситуациявозникает,когда изменениепоследовательностиаминокислотв соответствующем белке не полностью устраняетегоактивность.

Мутации по типу замены оснований приводяткпоявлениюдвухсортовмутантных кодонов в мРНК – с измененным смыслом (миссенс) и бессмысленного (нонсенс). Результатом миссенс-мутации, ведущей к изменению кодирующих триплетов, может быть замена одной аминокислоты в полипептиденадругую.Однако,посколькукод имеет вырожденный характер, не всякая мутация в кодоне приводит к замене аминокислоты. В этом случае происходит заменапарыоснованийвгене,котораязаменяет один кодон на другой, кодирующий ту же самую аминокислоту. Белок в данном случае сохраняет функции белка дикого типа. Такие мутацииназываютмолчащими.Крометого,не всякая замена аминокислоты отразится на функциональнойактивностибелка.Например,

кодон,образовавшийсяврезультатемутации, кодируетдругуюаминокислоту,носхимически эквивалентнымифункциями,напримервместо лизина стал аргинин. В результате свойства белка могут не измениться. Это нейтральные мутации. Следовательно, в обоих случаях мутация останется невыявленной. Это объясняет почему частоты мутаций в данном генеивстречаемостьмутантовпонемумогут несовпадать.

Примероммиссенс-мутацийможетбыть замена нуклеотида в шестом кодоне β -цепи гемоглобина у человека. У A-формы (Hb)β ) этоткодон(GAPurine)кодируетотрицательно заряженную глутаминовую кислоту. В результатезаменыAнаTвкодирующейцепив молекулебелкашестойаминокислотой сNH - конца становится нейтральный валин и образуется S-форма гемоглобина. Лица, гомозиготные по мутантному аллелю, кодирующему синтез аномальной S-бета- формы, страдают тяжелой формой гемолитическойанемии.Вусловияхнедостатка кислорода гемоглобин S образует кристаллоподобныесцепления,нарушающие морфологию эритроцитов. Они удлиняются, принимая серповидную форму. Такие аномальныеклеткимогутзакупоритьмелкие сосуды и прекратить тем самым доступ кислорода к различным тканям. Возникает болезнь серповидно-клеточная анемия.

К типу “нонсенс” относят мутации, приводящие к замене пар оснований, при которой кодон, определяющий какую-либо аминокислоту,превращаетсяводинизнонсенскодонов, не транслирующихся на рибосомах. Появление такого кодона не в конце структурного гена, а внутри него, приводит к преждевременнойтерминациитрансляции,т.е. кформированиюукороченнойполипептидной цепи. Подобная терминация, как правило сопровождается полным выключением функциифермента.

Мутации со двигом рамки считывания кодонов (frame shift), обусловленные вставками или выпадениями одного или несколькихнуклеотидов,напоминаютнонсенсмутации.

Очень часто ниже вставки или делеции возникаетноваярамкасчитывания,врезультате чегокужесинтезированнойчастиполипептида добавляется новый набор аминокислот, которые данным геном не кодируются. Возможнаситуация,когдаиз-засдвигарамки нарушаются и прочитываются существовавшие в нормальном гене стопкодоны и синтезируется более длинный полипептид. В любом случае, в итоге получается нефункциональный белок. Вторичная мутация может восстановить структуру нормального белка. Вот как остроумно проиллюстрировал это С.М. Гершензон (1983. cтр. 287-289).

“Длянаглядностиструктурубелкаможно изобразить последовательным рядом слов, состоящих из трех букв каждое, из которых образована какая-нибудь фраза, условно представляющаяинформацию,записаннуюв данномотрезкеДНК,например:

“âîò ëåñ âÿç äóá áóê èâû òóò áûë ïàë äûì øåë òðè äíÿ”

Допустим, что первичная мутация заключалась во вставке лишнего нуклеотида (т.е. какой-нибудь буквы) между вторым и третьимтриплетом(словом)фразы:

Вставка

↓

“âîò ëåñ à âÿç äóá áóê èâû òóò áûë ïàë äûì øåë òðè äíÿ”.

После возникновения такой вставки, получим:

“âîò ëåñ àâÿ çäó ááó êèâ ûòó òáû ëïà ëäû ìøå ëòð èäí ÿ”

Заисключениемпервыхдвухтриплетов (слов) все остальные оказываются замененными совсем другими, т.е. последовательностьчередованияаминокислот в белке, кодируемом данным геном, будет совершенно иной, чем до возникновения мутации, и ген утратит свою нормальную функцию.

Пусть теперь в этом отрезке возникнет вторичная мутация, заключающаяся в выпадении какого-нибудь нуклеотида (т.е. буквы) поблизости от точки первичной мутации, например, в четвертом триплете (“зду”)будетутерянабуква“з”:

Выпадение

↓

“âîò ëåñ àâÿ çäó ááó êèâ ûòó òáû ëïà ëäû ìøå ëòð èäí ÿ”

Припрочтениитриплетамиполучается:

“âîò ëåñ àâÿ äóá áóê èâû òóò áûë ïàë äûì øåë òðè äíÿ”

Смысл информации, заключенной во фразе, восстановлен почти полностью – утерянозначениетолькоодногослова(“вяз”). Последовательностьаминокислотвмолекуле белка, кодируемого геном, станет почти нормальной – изменится лишь единственная аминокислота(третьяслева)средимножества, из которых эта молекула построена. В большинстве случаев это не отразится или лишь незначительно отразится на биологическихсвойствахданногобелка,т.е.ген будетфункционироватьнормальноилипочти нормально.

Рассуждаяаналогичнымобразом,можно объяснить подавление проявления и такой первичноймутации,прикоторойпроизошлане вставка, а выпадение нуклеотида из ДНК. Толькотутпридетсядопустить,чтовторичная мутация, возникшая вблизи первичной, заключалась не в выпадении, а во вставке нуклеотида.Проиллюстрироватьэтоможнотой жефразой.

Первичнаямутация(выпадениебуквы“з” втретьемтриплете):

Выпадение

↓

“âîò ëåñ âÿç äóá áóê èâû òóò áûë ïàë äûì øåë òðè äíÿ”.

Припрочтениитриплетамисмыслфразы теряется:

“âîò ëåñ âÿä óáá óêè âûò óòá ûëï àëä ûìø åëò ðèä íÿ”.

Вторичная мутация (вставка буквы “а” междувторымитретьимтриплетом):

Вставка

↓

“вотлесавядуббукивытутбылпалдымш елт рид ня”

Припрочтениитриплетамиполучается:

“âîò ëåñ àâÿ äóá áóê èâû òóò áûë ïàë äûì øåë òðè äíÿ”

Смыслинформациивосстановленпочти полностью. Как и в предыдущем примере, утеряно значение только одного слова. Ген будетфункционироватьнормальноилипочти нормально.”

Полярные мутации – это мутации, инактивирующиеодинизгеновоперона.Такие мутации инактивируют не только тот ген, в котором они возникают, но и все другие гены, расположенные дистальнее от первого по отношению к промотор-операторной регуляторной области. Подобные эффекты вызываются нонсенс-мутациями, причем степеньихполярностивыраженатемсильнее, чемближенонсенс-триплеткрегуляторнойзоне.

Мутацииочень часто концентрируютсяв горячихточках.Еслирассматриватьмутациив терминахинактивациигена,большинствогенов у вида обнаруживают более или менее одинаковуюскоростьмутированияна единицу длины ДНК.Этопредполагает,чтогенможет рассматриваться как мишень для мутагенов и что повреждение любой части гена может изменитьегофункционирование.Врезультате, возможностьмутированиявцеломкоррелирует сразмеромгена.Однако,возникаетвопрос,все липарыоснованийравнымобразомодинаково чувствительныквоздействиюмутагенов.Чтобы ответить на этот вопрос, обычно подбирают большуюколлекциюмутацийодногоитогоже гена,затемопределяютсайткаждоймутации. Большинствомутацийрасположеновразличных

участках гена, но некоторые из них повторяются.Врезультате,внекоторыхсайтах расположенынеодна,адве,триидаже10и100. Такие участки гена называются горячими точкамимутирования(hotspots).Горячиеточки не универсальны для всех типов мутаций. Различныемутагеныимеютразличныегорячие точки (см. Рис. 8.4).

На Рис. 8.1 показано распределение частот,скоторыминаходятспонтанныемутации влокусеrII фагаT4.

Литература к разделу 8.1.1.

АлиханянС.И.,АкифьевА.П.,ЧернинЛ.С.Общая генетика. Москва, Высшая школа, 153-157, 1985.

Гершензон С.М. Основы современной генетики. Киев, Наукова Думка, 358-362, 1983.

BenzerS.Onthetopographyofthegeneticfinestructure.

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A."%: 403-415,1961. LewinÂ.GenesV.Oxford,NewYork,Tokyo,Oxford

UniversityPress,101-107, 1994.

Russell, P.J. Genetics Fifth edition. Addison Wesley Longman,Ins,MenloPark,California,616-637, 1998.

8.1.2. Мутации, индуцируемые инсерциями мобильных элементов

Долгое время точковые мутации внутри гена, вроде транзиций и трансверсий,

рассматривалисьосновнымтипомизменений индивидуальных генов. Однако, мы теперь знаем,чтовесьмачастымимогутбытьинсерции мобильных элеменов генома. В результате инсерции гены, как правило, более не дают нормального фенотипа. Если мобильный элемент вырезается из места встройки, могут возникнутьделецииприлегающегоматериала.

Значительноеразличиемеждуточковыми мутациями и инсерциями или перемещением мобильных элементов заключается в том, что частотаточковыхмутацийможетувеличиваться посредствомобработкимутагенами,втовремя как результаты перемещений мобильных элементовнезависятотмутагенов.

Литература к разделу 8.1.2.

LewinÂ.GenesV.Oxford,NewYork,Tokyo,Oxford

University Press, 102, 1994.

8.1.3. Мутации, обусловленные экспансией тринуклеотидных повторов

В 1991 году А.Дж.М.Х. Феркерк и его коллегиидентифицировалигенFMR-1(fragile X mental retardation 1), расположенный в хрупком (fragile) сайте между бэндами q27 и q28 в X-хромосоме человека. Ген экспрессируетсявклеткахмозга.Умутантовгемизигот развивается умеренная степень

умственной отсталости (IQ ~ 50). На долю мутантовпоэтомугенуприходитсяпримерно четверть всех психических заболеваний у мужчин. С гена считывается мРНК размером 4.8т.п.н.,кодирующаябелок,состоящийиз657 аминокислотных остатков. Выше кодирующего района расположен сегмент, в которомтриплетCGGповторен примерно 30 раз.Унекоторыхособейчислокопийтриплета увеличено до 50-100. У них появляется цитологическийвыявляемыйхрупкийсайтвXхромосоме. Мужчины, носители этого X.- аллеляобнаруживаютнормальноеумственное развитие,ноонистановятся«переносчиками».

ÂF дочери,получившиеэтотX. аллель,также имеют нормальный IQ. Однако, в этой хромосоме начинается экспансия CGGповтора, когда она передается следующему поколению.Посколькуэкспансияпроисходит в раннем эмбриогенезе, потомки F будут мозаичными.Вклеткахзародышевогопутиген имеет 50-200 копий повтора, хотя в других клетках их может быть уже несколько тысяч.

Âпоследнем случае ген FMR1, естественно, не функционирует, и нормальный уровень умственногоразвитиянедостигается.

По крайней мере в 50 генах в геноме человека содержатся по пять или более повторенныхтриплетов.Ипокрайнеймере,12 болезнейучеловекаобусловленыэкспансией тринуклеотидныхповторов (Рис. 8.2).

Можно вывести некоторые характеристикиэтоготипамутирования.

1.Нестабильность числа копий тринуклеотидныхповторовначинаетсяпосле достижения определенного порога (35-50 копийповтора),послечегоихчислоначинает быстро увеличиваться в последующих поколениях.

2.Всеизвестныедосихпормутацииэтого сортаподразделяютсянадвегруппы(Рис.8.2). В первую входят мутации, обусловленные массивной экспансией в некодирующих районах. Вторая группа заключает мутации, обусловленные умеренной экспансией CAG повторов, кодирующих полиглутамин, что может привести к трансляции токсического белкаспоследующейгибельюнейронов.

Литература к разделу 8.1.3.

MorellV.Thepuzzleofthetriplerepeats.Science $ :

1422-1423, 1993.

структуре тPНK, затрагивающих специфичность взаимодействий между кодоном и антикодоном и между тPНK и аминокислотой. В любом случае мутантная тPНK может включить в синтезирующуюся полипептидную цепь другую аминокислоту вместо той, которая кодируется триплетом с миссенс-мутацией. Один из наиболее изученных примеров такой супрессии – изменение нуклеотидов в антикодоне тирозиновой тPНK у E.coli, приводящее к тому, что тPНK, у которой в результате супрессорноймутацииантикодон3’-UUC-5’ сменился на 3’-AUC-5’ (Рис. 8.3). Подобная супрессия удается лишь в том случае, если подставленная напротив нонсенс-кодона аминокислота не нарушит нормального функционирования фермента. Следует подчеркнуть, что для нонсенс-супрессоров характерна кодон-специфичность, но не генспецифичность. Это означает, что амберсупрессор способен восстановить активность различных генов с амбермутациями независимо от того, где локализованы мутантные гены, но не

обусловливает реверсии к дикому типу у тех же генов, если они несут не амбер- , а какуюто иную мутацию. Вследствие такой плейотропности действия нонсенссупрессоров их часто называют суперсупрессорами.

Литература к разделу 8.1.4.

АлиханянС.И.,АкифьевА.П.,ЧернинЛ.С.Общая генетика. Москва, Высшая школа, 157-160, 1985.

Russell, P.J. Genetics Fifth edition. Addison Wesley Longman,Ins,MenloPark,California,622-624, 1998.

8.1.5. Причины мутирования

Мутации бывают спонтанными, т.е. возникающими в природе без видимых причин, и индуцированные различными мутагенами.

Все типы мутаций могут происходить спонтанно.Долгоевремягенетикиполагали, что спонтанные мутации индуцируются мутагенами окружающей среды, такими как естественный фон радиации и загрязнение

Ультрафиолетовый свет не является ионизирующим, тем не менее, это довольно эффективныймутаген.Связаноэтостем,что пуриныипиримидиныинтенсивнопоглощают ультрафиолет с длиной волны 254-260 нм, в результате чего возникают фотохимические изменения в структуре ДНК. Одним из результатов ультрафиолетового облучения является формирование ненормальных химических связей между прилегающими молекулами пиримидинов в одной и той же цепи ДНК или пиримидинами на противоположных цепях. Чаще всего образуются тиминовые димеры (Рис. 8.5), обозначаемые как TT. Со значительно меньшей частотой образуются димеры других пиримидинов: CC, CT è TC. Возникновение димера приводит к выпячиванию в цепи ДНК. Большинство такихнарушенийрепарируется(см.Рис.8.9), оставшиеся нерепарированными - приводят к мутациям.

Многие химические соединения могут индуцировать мутации. Это могут быть аналоги оснований, соединения, модифицирующие основания или интеркалирующиеагенты:

Аналогиоснований.Аналогиоснований имеют молекулярную структуру, которая очень похожа на основания, нормально входящие в цепи ДНК. Эти соединения приводят к мутациям потому, что они могут существовать в альтернативных (таутомерных)состояниях.Вкаждомиздвух состояний аналоги спариваются с различными нормальными основаниями в

результате чего может произойти их замена. Например, 5-бромоурацил в нормальном состоянии спаривается с аденином, в более редком таутомерном состоянии – с гуанином. В результате 5-бромоурацил индуцирует транзицию, когда включается в ДНК в одном состоянии, затем в следующем раунде репликации ДНК это основание превращается в более редкую таутомерную форму. Другим широко известным аналогом оснований является 2-аминопурин.

Агенты, модифицирующие основания. Ряд химических агентов действует как мутагены, непосредственно модифицируя химическую структуру и свойства оснований. Существует три типа мутагенов, действующих в этом направлении: дезаминирующие, гидроксилирующие и алкилирующиеагенты.

Азотистая кислота (HNO2) – это агент, осуществляющий окислительное дезаминирование, т.е. удаляющий аминогруппы (-NH2) из таких оснований как гуанин, цитозин и аденин. В результате дезаминированиягуанинаазотистойкислотой образуетсяксантин,нотаккакэтопуриновое основание имеет тот же самый тип спаривания,мутациянепроявляется.Однако, когда модифицируется цитозин, получается урацил (который спаривается с аденином). В итогепроисходиттранзицияотCGкTAвходе акта репликации. Аналогичным образом азотистая кислота модифицирует аденин в гипоксантин-основание, спаривающееся с цитозином а не тимином, что продуцирует транзициюATвGC.Мутации,индуцируемые