Подготовка у универсиаде 2012 / Генетика (Жимулев) / 7-1ver7

Структура гена

Глава 7

Рисунок 7.8

Tcr

1

2

3

Ампициллин

Apr

pBR322

Ô

Трансформация

à

Посев на

со встроенным

чашки Петри

фрагментом ДНК

Tc r

1

2

3

Тетрациклин

E. coli

Ap r

á

pBR322

Tcr Трансформация

Посев на

чашки Петри

E. coli

Тетрациклин

Глава 7

Структура гена

Рисунок 7.10

рестрикционных карт), два сайта

инсерции(HindIIIиBamHI),атакже

XmaI / SmaI

несколько C+G - богатых сайта

NotI / EagI

NotI / BglI / SfiI

LoxP

HindIII

BamHI

рестрикции (NotI, EagI, XmaI, SmaI,

BglI и SfiI) (Рис. 7.10). Размер

промотор T7

промотор Sp6

клонируемогофрагментасоставляет

около 300 т.п.н. Наличие колоний

клеток, содержащих инсерцию,

SacI

cosN

определяется по гибридизации на

фильтрахсклонируемойДНК.

SalI

SalI

SacI

Плазмиды

иногда

встречаются

ó

эукариот.

Большинство эукариотических

parB

CMR

плазмиднепроявляютсявфенотипе

и обнаруживаются

только с

помощью молекулярных методов.

Наиболееизвестнот.н.2-микронное

parA

pBAC108L

кольцо (2µ -circle) у дрожжей. Ее

также можно

использовать в

oriS

качествевектораприклонировании

(см. раздел 8.3.2.2).

repE

7.4.2.2. Фаговые

Строение плазмиды pBAC108L (Из: Shizuya et al., 1992).

векторы

нерастворимого в воде осадка, окрашенного

Наиболее часто используемые

фаговые векторы являются производными

всинийцвет.

фага λ . Левое и правое плечи фага имеют все

Клетки,

â

которых

произошла

трансформация плазмидой, отбирают по их

гены, необходимые для литического цикла;

способностижитьнасредесампициллином.Те

напротив,гены,контролирующиелизогению, и

клетки, которые содержат плазмиды со

расположенные в норме между плечами,

встроенной ДНК, образуют неокрашенные

удалены. Такие модифицированные фаги

колонии.Есликолонииокрашенывсинийцвет,

проходят литический цикл, но лизогения не

значит в этих клетках плазмиды не содержат

происходит.

Между

двумя

плечами

встройки.

помещается заменяемый фрагмент ДНК,

Бактериальные

искусственные

которыйненужендляразвитияфага(Рис.7.11).

хромосомы

(BAC-bacterial

artificial

Настыкезаменяемогоцентральногофрагмента

chromosome) приготовлены на основе

икаждогоизплечнаходитсяодинитотжесайт

плазмиды F-фактора

E. coli (Shizuya et al.,

рестрикции,например, EcoRI.Другоготакого

1992). Эта плазмида (Рис. 7.10) имеет гены,

сайта в плечах данного фага нет. В ходе

которыенетолькоконтролируютрепликацию

клонированияДНКфагарежутрестриктазой

ее ДНК, но и число копий в клетке.

EcoRI,клонируемыйфрагментДНКрежутэтим

Регуляторные гены включают oriS, rep E

же ферментом, затем

плечи фага и

(контрольоднонаправленностирепликацииF-

фактора), parA и parB (поддержание числа

клонируемыйфрагментсмешивают,отжигают

копий на уровне 1-2 на клетку E.coli). Кроме

изатемлигируютстыкицепей.

того в плазмиде есть гены резистентности к

Вчастицуλ фагаможетупаковатьсяДНК

хлорамфениколу (CMR) и сегмент

длиной37-52т.п.н.,наплечиприходитсяоколо

клонирования. Последний включает сайты

30 т.п.н., т.е. размер вставки может быть 7-22

бактериофагов λ

cosN и P1loxP (эти два сайта

т.п.н.,всреднемоколо15т.п.н.Фагибезвставок

дают возможность получения концов,

или,напротивсослишкомбольшимивставками

используемых

äëÿ

построения

не развиваются и не поражают бактерии, на

Структура гена

Глава 7

Рисунок 7.11

фрагментовДНК(Рис.7.13).Кроме

ÄÍÊ ôàãà λ

этого, космиды имеют cos-сайт,

происходящийизфагаλ .Cos-сайты

EcoRI

EcoRI

Клонируемая ДНК

- это участки, в которых

многочисленные копии геномов λ -

фага,объединенныевдлиннуюцепь,

45 ò.ï.í.

EcoRI

называемую

конкатамером,

EcoRI

разрезаютсянафрагментыдлиной48

5’

3’

5’

3’

Левое плечо ~ 15 т.п.н. Правое плечо

т.п.н.,пакуемыевфаговыеголовки.

3’

5’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

Cos-сайты фага λ

введены в

3’

5’ 3’ 5’

Рестрикционные фрагменты

плазмидуиполучаютсянебольшие

различного размера

космиды размером около 5 т.п.н.

Не влияет на

15 ò.ï.í.

репликацию фага λ

5’

3’

КогдафрагментыДНКразмером32-

Плечи содержат все

3’

5’

47 т.п.н. встраиваются в такую

Фрагмент подходящего

гены необходимые для

размера для упаковки

космиду, молекуладостигаетнужной

репликации, но слишком

малы для упаковки

длины,чтобыупаковатьсявфаговую

3’

5’

5’

3’

частицу. Этот фаг затем вводится в

клеткуE.coli.

Размер

клонируемого

фрагмента ДНК в космидном

λ

векторесоставляет35-45т.п.н.(Из:

Упаковка ДНК в частицу фага

заражение клеток E. coli äëÿ

Russell, 1998, p.455).

размножения фага и клонирования ДНК

Схема клонирования ДНК с использованием фага λ

â

7.4.2.4. Челночные

качестве вектора (Из: Russell, 1998, p. 456).

векторы

газонахE.coli выедаютсят.н.бляшки(plaques)

Это векторы, которые способны

реплицироваться в двух и более организмах-

фагами,имеющимивставкинужногоразмера.

хозяевах. На рис. 7.14 показан вектор,

Некоторые

бактериофаги

имеют

относительнобольшиегеномы,чтопозволяет способныйразмножатьсявклеткахдрожжейи

внедрить в

íèõ

крупные

фрагменты

E.coli.

чужероднойДНК.Уодногоизтакихфагов,P1,

Плазмида

YEp24

имеет

последовательность ori, позволяющую

геном размером110-115 т.п.н. упаковывается

в белковую оболочку. В генно-инженерных

реплицироваться в E. coli, и селекционные

опытахкомпонентыP1включенывкольцевую

Рисунок 7.13

плазмиду (Рис. 7.12, см. след. стр.). После

сайты для

этого плазмидный вектор P1 разрезают на 2

клонирования

плеча, в которых лигируют до 100 т.п.н.

чужероднойДНК.Затемрекомбинантныйфаг

ampR

поглощаетсяподходящейклеткой-хозяином.

7.4.2.3. Космидные векторы

Космида

cos ñàéò

Космидывприроденевстречаются,они

созданыискусственноврезультатекомбинации

плазмид и фага λ . Космида имеет

последовательность ori, позволяющую

ori

репликацию в E. coli, доминантный

Космидный вектор для клонирования (Из:

селекционныймаркерampR иуникальныесайты

рестрикции для инсерций и клонирования

Russell, 1998, p. 456).