Подготовка у универсиаде 2012 / Генетика (Жимулев) / 7-1ver7

Глава 7. Структура гена

7.1. Развитие представлений

îãåíå

Êконцу 20-x годов сложилось представление о гене как материальной частице, лежащей в хромосоме, способной к саморепродукции и являющейся минимальной единицей рекомбинации, мутирования и генетической функции. Цепочка сцепленных генов представлялась как нитка корпускул или бусинок, механически связанных друг с другом. Ген, согласно этим представлениям, считался неделимым с помощью кроссинговера. Нормальному аллелю противопоставлялся мутантный. Для обьяснения существования пар аллелей уже в 1902 г К. Корренс и У. Бэтсон предложили теорию, согласно которой доминантный признак обуславливается наличием определенного гена, а рецессивный - выпадением, отсутствием этого гена. Эта теория получила название теории “присутствия - отсутствия”. Она очень просто обьясняла существование пар аллей. Вначале признавал ее и Т.Морган. Однако, затем, когда были открыты большие серии промежуточных мутаций, в разной степени изменяющих признаки, т.е. серии аллельных генов, эта теория подверглась критике. Морган отказался от нее. Как писал А.С.Серебровский,“эпитафиейкэтойтеории явились слова Моргана: “Не могут одному присутствию отвечать несколько отсутствий”.

В целом представления школы Т.Х. Моргана можно кратко представить следующим образом: ген имеет основные свойства хромосом: способность к редупликации,способностькзакономерному распределению в митозе и мейозе. Ген занимает определенный участок (локус) хромосомы, это единица мутации, (т.е. ген изменяется как целое), единица рекомбинации (т.е. кроссинговера никогда не наблюдаливпределахгена),единицафункции (т.е. все мутации одного гена нарушают одну и ту же функцию). Поэтому при получении

серии мутации с похожим фенотипом для определения того, затронут мутациями один и тот же ген или разные, Морган предложил два теста: функциональный и рекомбинационный. Функциональный критерий основывается на том, что при скрещивании двух мутантов возникает дигетерозигота, имеющая дикий фенотип в силу доминирования нормальных аллелей каждого из генов (мутации комплементарны друг к другу). Если скрещиваемые мутанты несут в дигетерозиготе аллельные мутации, то дикий тип не появляется, т.к. оба аллеля одного и того же гена в разных хромосомах несут мутационные изменения, или подругму, мутации не комплементарны. При этом мутации не должны разделяться кроссинговером.

В 1929 г. А.С. Серебровский и Н.П. Дубинин описали серию индуцированных мутаций гена scute (sc), нарушающих формированиеразныхщетинокудрозофилы (Рис. 7.1).

Но самое поразительное выяснилось, когда получили самок, у которых в одной X-

Рисунок 7.1

Норма scute-1

scute-2 scute-3

scute-4 scute-5

scute-6 scute-7

Влияние разных мутаций гена scute на развитие щетинок у дрозофилы (Из: Серебровский, Дубинин, 1929).

хромосоме находился один аллель, а в другой хромосоме - другой аллель этого гена. В таких компаундах редуцированными были только те щетинки, которые повреждались обоими аллелями, а щетинки, развитые у мутантов по одному из них и редуцированные у мутантов по другому, в компаунде оказывались нормальными. Более того,еслидвааллелянарушалиразвитиесовсем разных щетинок, то в компаунде они давали возврат к норме: развивались все щетинки, напримеруособейsc5/sc6,чтобылопоказанов работе Серебровского в 1930-м году, после тогокаконполучилмутациюsc6. Обсуждая эти факты, авторы написали: “...явление частичноговозвратакдикомутипуможетбыть истолковано как обусловленное не полным аллелизмомдвухаллелей.Сэтойточкизрения...

общие части проявляются в силу того, что в обеих хромосомах имеются изменения одинаковыхучастков,другимисловами,поэтим участкаммухагомозиготна;непроявлениеже несовпадающих участков зависит оттого, что измененному участку одной хромосомы соответствует участок второй хромосомы, которыйнебылзатронуттрансгенацией...”.И далее особенно важный вывод: “Это весьма

ответственное воззрение, утверждающее ДЕЛИМОСТЬ гена...” Была построена карта нарушенийщетинок(Рис.7.2).

Авторы назвали ген scute базигеном, т.е. участком хромосомы, занимаемым всеми изменениями - трансгенами scute. Самостоятельныепритрансгенациях(мутациях) элементарные участки внутри базигена были названыцентрами.Мутациимогутзахватывать какотдельныецентры,такицелыеихгруппы. Приэтомаллелирасположеныступенчато.

Эта теория сложного (центрового) строения, или делимости гена, имеющего одномерную протяженность, не была поддержана крупнейшими генетиками того времени (А. Стертевантом, Дж. Шульцем, Р. Гольдшмидтом, Г. Меллером) (см. Хесин, 1972).

Много позже М. Грин и К. Грин (1949) показали делимость гена lz у дрозофилы посредством кроссинговера. Они получили гетерозигот,

lz B S

lz g

Рисунок 7.2

План гена (“базигена”) scute и его мутаций (“трансгенаций”), (Из: Серебровский и Дубинин, 1929). Мутации нарушают развитие щетинок на разных частях тела мух: dc - дорзоцентральные; v1, v2 - вертикальные, s.a. - супраалярные; v - вентральные; p.s. - пресутуральные; or1, 2, 3 - орбитальные; p.a. - посталярные; n1, 2 - нотоплевральные; oc - оцеллярные; cx - коксальные; p.v. - поствертикальные; st - стернальные; sc - скутеллярные; hum - гумеральные.

0,1% потомков от которых обнаруживалилибонормальныеглаза, либо более сильное мутантное проявление, чем любой из аллелей. Это могло произойти только в результате кроссинговера внутри этого гена. Чтобы спасти представление о неделимости гена, такие аллели стали называть псевдоаллелями.

После того, как установили, что ген можно разделить кроссинговером,сталиискатьновые варианты определения гена и модификациифункциональноготеста. Э.Льюиспредложилцис-транс-тест, суть которого в том, что при скрещивании двух особей, несущих мутациивнегомологичныхучастках хромосомы, возникает зигота с трансконфигурацией этих мутаций.

Еслимутациикомплементарны,т.е.появляется гибриддикоготипа,томутацииотносяткразным генам.Еслигибридоказываетсямутантным,то обемутацииотносяткодномугену,т.е.считают ихаллельными.Прискрещиваниидвухособей, однаизкоторыхнесетобаэтихгенотипических изменения,адругаяпредставляетсобойдикий тип, образуется зигота с цис-конфигурацией мутаций.Гибриддикоготипавозникаетитогда, когдаобемутациизатрагиваютодингеникогда оказываются мутантными два разных гена. Таким образом, цис-транс-тест сводится фактически к транс-тесту, т.е. к функциональному критерию аллелизма, предложенномуранееМорганом.

Огромныйвкладвпониманиеструктурыи функции гена внесли Дж. Бидл и Э. Тейтум, которые в начале 1940-x годов впервые исследовали биохимические мутации у Neurosporacrassa.Этиисследованияпоказали, что мутации ауксотрофности у нейроспоры прерывают цепи метаболизма на конкретных этапах. При этом аллельные мутации всегда затрагивалиодинитотжеэтапбиосинтеза.На основесвоихрезультатовДж.БидлиЭ.Тейтум сформировали принцип “один ген - один фермент”, означавший, что каждый ген контролирует синтез какого-либо определ¸нногофермента.

В 1961 году С. Бензер изучал область rII фагаТ4.Онсопоставилмолекулярныеразмеры этой области - 2700 п.н. и рекомбинационную длину-10%.Вэкспериментахбылиполучены минимальные частоты рекомбинации около

Дополнение 7.1

За открытие того, что ген действует, регулируя определенные химические события, Дж. Бидл и Э. Тейтум (G.W. Beadle, E.L. Tatum) получили Нобелевскую премию в 1958 году.

0,02%, т.е. 1/500 часть от всего рекомбинационногорасстояния(10%).Еслився длина района 2700 п.н., значит рекомбинация происходитмеждукаждыми5-6нуклеотидами (2700:500).

Позже У. Яновский показал, что кроссинговерпроисходитмеждулюбойпарой нуклеотидов.Этапарабыланазванареконом.

Такимобразом,нетолькоген,ноилюбая его часть могут быть разделены с помощью кроссинговера.

В1957годуС.Бензерпредложилназывать участок хромосомы, в пределах которого обнаруживаетсяцис-транс-эффект,цистроном. Цистронопределяетоднуфункцию.

Ген по современным представлениям можноопределитькакединицунаследственной информации, занимающую определенное положение в геноме или хромосоме и контролирующуювыполнение определенной функциив организме.

Организация генов несколько различна упро–иуэукариот.Сначалабудетрассмотрен оперонный принцип строения генов у прокариот, затем, после характеристики современных методов изучения генов, будут изложены основы организации генов у эукариот.

Литература к разделу 7.1.

Инге-ВечтомовС.Г.Генетикасосновамиселекции. Москва,Высшая школа, 370-380, 1989.

Лобашев М.Е. Генетика. Ленинград, Издат. ЛГУ, 454-464, 1967.

Серебровский А.С., Дубинин Н.П. Искусственное получение мутаций и проблема гена. Успехи эксп. биол. 4: 235247, 1929. Перепечатано в: «Классики советской генетики, Ленинград, Наука, 294-302, 1968.

Хесин Р.Б. Теория гена в работах А.С. Серебровского. Природа 8: 16-27, 1972.

7.2. Оперонный принцип организации генов у прокариот

Бактериям необходимо уметь быстро отвечатьнаизменениявокружающейсреде.Их выживаемость зависит от способности переключатьметаболизмсодногосубстратана

другой, поскольку поступление питательных веществможетпостоянноменяться.

Бактериянесинтезируетферментовтого илииногометаболическогопутивотсутствие соответствующего субстрата, но способна в любое время начать их синтез при появлении такового. Для осуществления подобного реагирования гены бактерий объединены в кластеры таким образом, что ферменты, необходимые для осуществления определенного пути биосинтеза, кодируются генами, находящимися под общим контролем.

Клетки E. coli в отсутствие бетагалактозида содержат очень незначительное числомолекулфермента,расщепляющегоего -буквальнонесколькоштук.Функцияфермента сводится к расщеплению молекулы бетагалактозиданасоставляющиесахара.Например, лактоза разлагается на глюкозу и галактозу, которые в свою очередь используются в дальнейшем метаболизме. При добавлении галактозида в бактериальных клетках очень быстро усиливается активность фермента в результате синтеза новых молекул, которые появляютсяужечерез2-3мин.Вскореихчисло в клетке превышает 5000. При удалении субстрата из среды синтез фермента прекращаетсятакжебыстро,какбылначат.

Быстроеувеличениеактивностифермента за счет его синтеза под действием субстрата называется индукцией, а уменьшение активности, также под действием субстрата - репрессиейгенов.

Гены можно поделить на две группы по принципудействияихпродукта.Гены,которые кодируют белки, необходимые для ферментативных или структурных функций, называются структурными. Большинство генов бактерий попадают в эту категорию, которая,такимобразом,представленаогромным разнообразиемфункцийиструктурбелков.

Гены, кодирующие белки, которые регулируют экспрессию других генов, называются регуляторными. Поскольку продукты регуляторных генов свободно диффундируютинаходятподходящиемишени дляактивирования,такойтипвзаимодействий

генов называют транс-регуляцией. Трансдействующий белок может регулировать генмишень либо позитивно, если в результате взаимодействиярегулируемыйгенвключается, или негативно, если он выключается. Белокрегулятор связывается с цис-регулирующей последовательностью регулируемого гена, которая располагается обычно (но не всегда) вышегена-мишени.

Структурные гены бактерий имеют тенденциюбытьорганизованнымивкластеры генов,кодирующихбелки,чьифункциисвязаны.

ПримеромкластернойорганизацииуE.coli являются лактозные гены, которые индуцируютсяирепрессируютсяподдействием субстрата.

Весь кластер генов занимает около 6000 п.н. (Рис. 7.3). Ген lacI имеет свой промотор и терминатор.КонецрайонаlacIнепосредственно примыкаеткпромоторуlac(P),операторlac(O) занимает первые 26 п.н. гена lacZ. После гена lacZ,которыйимеетнеобычнобольшуюдлину, расположеныгеныlacY иlacA,атакжеобщий терминатортранскрипции.

Геныимеютследующиефункции:продукт lacZ расщепляет бета-галактозид на составляющиеегосахара,например,лактозуна глюкозуигалактозу,продуктгенаlacYявляется бета-галактозидпермеазой,онтранспортирует бета-галактозид в клетку. Ген lacА кодирует белок трансацетилазу - энзим, который переноситацетильнуюгруппусацетил-СоАна бета-галактозид.

Мутации генов lacZ и lacY дают lacфенотип, когда клетки не могут использовать лактозу. У мутантов lacZ- отсутствует ферментативнаяактивностьбета-галактозидазы. МутантыпогенуlacYнемогутусваиватьлактозу изсреды.МутантыlacА- непроявляютфенотипа, чтодовольнонеожиданно.

Вся эта система, включающая структурныегеныиэлементы,контролирующие

Дополнение 7.2

За открытие механизмов генетического контроля синтеза ферментов Нобелевскую премию в 1965 году получили Ф. Жакоб, А. Львов и Ж. Моно (Francois Jacob, Andre Lwoff, Jaques Monod).

количества всех трех ферментов остаются одинаковыминезависимоотусловийиндукции.

Поданным,полученнымвходереализации геномного проекта E.coli, завершившегося в 1997 году полным секвенированием ДНК, всеговгеномекишечнойпалочкивыявленои предсказано 2584 оперона. Среди них: 73% содержатодинцистрон,16%-2цистрона,4,6% - 3 цистрона (в том числе lac-оперон), 6% - 4 и более цистронов (в том числе trp - , his – опероны). Все они имеют не менее одного промотора и управляются регуляторными белкамичерезспецифическиефункциональные сайтыуправления(Blattneretal.,1997;Ратнер, 2000).

У эукариот опероны не обнаружены.

Литература к разделу 7.2.

Алиханян С.И., Акифьев А.П., Чернин Л.С. Общая генетика. Москва, Высшая школа, 239-252, 1985.

Льюин Б. Гены. Москва, Мир, 176-201, 1987. Ратнер В.А. Что содержит полный геном

Escherichia coli? Соросовский обр. журн., в печати, 2000.

Blattner F.R. et. al., The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 277: 1453-1462, 1997.

Brenner S. A night at the operon. Nature 386: 235, 1997.

Curtis H., Barnes N.S. Biology. Fifth Edition. Worth Publishers, Inc. New York, 320-326,1989.

Lewin Â. Genes V. Oxford, New York, Tokyo, Oxford University Press, 413-432, 1994.

7.3. Химический синтез генов

Известнонесколькоспособовполучения генов:

1.Непосредственное выделение из природныхисточников(клонирование).

2.Химическийсинтез.

3.Копирование соответствующей гену мРНКдляполучениякомплементарнойДНКреплики(кДНК).

Искусственныйсинтезгенабылвпервые осуществленхимическимпутемв1969годуГ. Хораной и его сотрудниками. Группа Хораны синтезировалагеналаниновойтРНКдрожжей, структура которого к тому времени была

полностьюрасшифрована.Синтезированныйген длиной 77 п.н. не содержал регуляторных последовательностей и поэтому не обладал функциональнойактивностью.Позднеетаже группа авторов синтезировала первый функциональноактивныйген-генсупрессорной тирозиновойтРНКE.coliдлинойоколо200п.н.

Искусственно синтезированные гены могутэкспрессироватьсявсоставегибридных молекул микроорганизмов. Первой удачной попыткойтакогородасталаработаК.Итакуры иГ.Бойерассоавторами(1977)поэкспрессии в E. coli гена, кодирующего гормон млекопитающих - соматостатин. Ген соматостатина был синтезирован на основе сведений о первичном строении этого пептидного гормона, состоящего всего из 14 аминокислот.Вразличныхлабораторияхбыли созданы штаммы E. coli, синтезирующие гормон роста человека - соматотропин, пептидныегормоны-брадикининиангиотензин, нейропептидлей-энкефалин,генинтерферона размером200п.н.идр.

Генгормонаростачеловекадлиной 584 п.н. - наиболее длинный из искусственно синтезированных в настоящее время. Он был встроенвплазмиду,реплицирующуюсявE.coli под контролем промотора триптофанового оперона. Трансформированные полученной химерной плазмидой клетки E. coli продуцировалиприиндукциипромотораоколо 3 млн. молекул гормона роста человека в расчете на клетку. Этот полипептид, как было установлено в экспериментах на крысах с удаленнымгипофизом,пофункциямоказался полностьюидентиченгормонуростачеловека.

Генинсулинасинтезироваливвидеболее чем 40 шестичленных олигонуклеотидов, которыезатемобьединяливединуюструктуру с помощью ДНК-лигазы. Полученные двуцепочечныеполинуклеотидыдлиной271и 286 п.н. были встроены в плазмиды. Туда же были встроены регуляторные участки ДНК, обеспечивающие экспрессию гибридных молекул. Клонированные гены кодировали синтезпроинсулина,которыйпутемнесложной химической обработки можно превратить в активный инсулин, включающий две

полипептидные цепи A и B из 21 и 30 аминокислотныхостатков,соединенныхмежду собойсульфгидрильнымисвязями.

Используется также метод искусственногополучениягенов,основанныйна их ферментативном синтезе с помощью механизма обратной транскрипции. Этот механизмсвязансактивностьюРНК-зависимой ДНК-полимеразыилиобратнойтранскриптазы (ревертазы)-ферментавпервыеобнаруженного приисследованиирепликацииРНКонкогенных вирусов.ФерментспособенстроитькопииДНК на разных РНК, включая синтетические полирибонуклеотиды.Спомощьюревертазы можносинтезироватьпрактическилюбойгенв присутствиисоответствующихмРНК,методы выделения которых достаточно хорошо разработаны.Данныйметодудобноприменять для выделения генов, исключительно интенсивнотранскрибируемыхвопределенной ткани.

Такимспособомполученыиклонированы гены, кодирующие глобины человека, других млекопитающихиптиц,белокхрусталикаглаза быка, яичный белок, фиброин шелка и некоторые другие.

Литература к разделу 7.3.

АлиханянС.И.,АкифьевА.П.,ЧернинЛ.С.Общая генетика. Москва, Высшая школа, 415-418, 1985.

7.4. Современные методы молекулярной генетики

Впроцессмолекулярногоклонирования (избирательного накопления) молекул ДНК входит несколько этапов: фрагментация ДНК путемобработкиэндонуклеазойрестрикции, объединения этих фрагментов in vitro с векторной молекулой ДНК (способной к автономнойрепликации),введениевекторав реципиентный организм, в котором и происходитнакоплениерекомбинантныхДНК.

Формальной датой рождения генной инженериисчитают1972год,когдагруппаП. БергавСШАсоздалапервуюрекомбинантную ДНК in vitro, объединившую в своем составе генетический материал из трех источников: полный геном онкогенного вируса обезьян

SV40,частьгеномаумеренногобактериофага лямбда и гены лактозного оперона E. coli. Сконструированнаярекомбинантнаямолекула не была исследована на функциональную активность, поскольку у авторов возникли опасения,чтометодыгеннойинженериимогут привести к появлению микроорганизмов, опасных для здоровья человека, например, бактерий E. coli, способных перенести онкогенные вирусы животных в кишечник человека.

Функционально активные молекулы гибридной ДНК были впервые получены С. Коэном, Д. Хелинским, Г. Бойером и их сотрудниками в 1972-1973 гг.

7.4.1.Ферменты рестрикции

Â1962 году В. Арбер показал, что в бактерияхдействуютспециальныеферменты, способные специфично отличать свою (бактериальную) ДНК от чужой (фаговой). Эти ферменты рестрицируют (т.е. ограничивают) возможность размножения фаговойДНКвбактерияхпутемееболееили менее специфичной деградации. Такие ферменты были названы эндонуклеазами рестрикцииилирестриктазами.Естественной функцией рестриктаз является защита бактерииотинфекциивирусами.ДНКвсайтах рестрикцииусамойбактериимодифицирована метилированием,такчтоферментрестрикции не может расщеплять свою собственную ДНК. Однако вирусная ДНК не защищена метильными группами, и ферменты расщепляют ее.

Первая рестриктаза, специфично расщепляющая двухцепочечную ДНК в строго определенных сайтах, была выделена Г. Смитом и его сотрудниками в 1970 году из штамма Haemophilus influenzae. Она была обозначена HindIII.

Известны три класса рестриктаз, различающихся между собой по характеру узнавания и разрыва ДНК, структуре белка и условиям, необходимым для осуществления реакции. В генно-инженерных работах используют ферменты второго класса, разрывающие двухцепочечную ДНК в зоне