Подготовка у универсиаде 2012 / Генетика (Жимулев) / 7-2ver7

Структура гена

Глава 7

112 п.н., соответствующий гену амелогенина

7.4.9. Определение

в Y хромосоме, и 106 п.н., соответствующий

последовательности

этому же гену в Х хромосоме. У женщин

нуклеотидов (секвенирование)

имеется две Х хромосомы, каждая из

В 1970х годах были разработаны две

которых дает фрагмент 106 п.н. В

методики определения последовательностей

исследованных девяти образцах в 4 случаях

нуклеотидов в клонированных фрагментах

видны две полосы, а в 5 - одна полоса (Рис.

ДНК. Одну предложили А. Максам (A.

7.24). Следовательно, среди убитых было 4

Maxam) и У. Гилберт (W. Gilbert), другую –

мужчины и 5 женщин. Именно столько

Ф. Сэнгер (F. Sanger). Метод Сэнгера,

женщинбыловцарскойсемье,расстрелянной

используемый чаще, будет рассмотрен ниже.

в Екатеринбурге в июле 1918 года (Из:

ДНК денатурируют до однонитчатого

Янковский, 1996).

состояния щелочной обработкой

èëè

Литература к разделу 7.4.8.

нагреванием. Затем отжигают с одной из

нитейкороткийолигонуклеотидныйпраймер

Иванов П.Л. Молекулярно-генетическая

(Рис. 7.26). Олигонуклеотид синтезируется

индивидуализация человека. Автореферат

таким образом, чтобы его 3'-конец был

докт. диссер., Москва, 1995.

последним

перед

секвенируемой

Янковский Н.К. Молекулярно-генетические

методы в руках детектива, или опыт

последовательностью. Олигонуклеотид

исследования останков семьи последнего

служит праймером для достраивания цепи

российского императора. Соросовский

ДНК-полимеразой.

образовательный журнал 2: 21-27, 1996.

Для каждого эксперимента

ïî

MullisK.B.Theunusualoriginofthepolymerasechain

секвенированию ставятся четыре реакции с

reaction. Scientific American April: 56-65,

однонитчатой ДНК и прикрепленным к ней

1990.

праймером. Каждая реакционная смесь

Russell, P.J. Genetics Fifth edition. Addison Wesley

содержит

четыре

нормальных

Longman,Ins,MenloPark,California,476-478,

предшественника ДНК: dATP, dTTP, dCTP и

1998.

dGTP, а также ДНК-полимеразу (чаще

Глава 7

Структура гена

Рисунок 7.26

Радиоактивный

T

3’

олигонуклеотидный

C

праймер

G

достраивается

Анализируемая

G

ДНК-полимеразой

A

последовательность

T

C

T

G

A

5’

Реакция

ddA

ddG

ddC

ddT

5’

ddA A A

A A

A A A

A A

G G

ddG G

G G G

G G

Продукты

C C

C

ddC C C

C C

C C

C

ddC C

C C

ÄÍÊ

T T

T

T

ddT T

ddA A

A

A

A

G

ddG

G

G

ddA

A

A

ddC

C

3’

ddT

Число нуклеотидов

1 6 8

2 7

3 4 9

510

Длинные

ddA

ddG

ddC

ddT

фрагменты

10

меченогоДлина

фрагмента нуклеотидахв

9

8

7

6

5

4

3

2

Короткие

1

фрагменты

Структура гена

Глава 7

присутствием

òîãî

èëè

иного

Зеленин А.В. Генная терапия: этические

модифицированного

основания,

аспекты и проблемы генетической

называемого дидезоксинуклеотидом,

безопасности. Генетика 35: 1605-1612,

поскольку у этих нуклеотидов в 3' позиции

1999.

Лещинская И.Б. Генетическая инженерия.

дезоксирибозы находится H, а не OH как у

дезоксинуклеотидов. Дидезоксинуклеотид

Соросовский образовательный журнал

1: 32-39, 1997.

может включаться в растущую цепь ДНК,

Свердлов

Е.Д. Очерки

современной

однако на этом синтез останавливается,

молекулярной генетики. Молекулярная

поскольку отсутствие 3'-OH предотвращает

генетика, микробиология и вирусология

образование фосфодиэфирной связи с

2, 3, 4, 1995.

последующим нуклеотидом. Поэтому в

Фаворова О.О. Лечение генамифантастика

каждой реакционной смеси присутствуют по

èëè

реальность?

Соросовский

4 нормальных dNTP и один ddNTP, в

образовательный журнал 2: 21-27, 1997.

соотношении примерно 100:1. Таким

Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K.,

образом, ДНК растет от праймера до того

Watson J.D. Molecular biology of the cell

момента, когда

â îäíó

èç

позиций

(Third edition) Garland Publishing, Inc. New

York, London, 287-301, 1994.

встраивается дидезоксинуклеотид. Поэтому

Antonarakis S.E., Scott H.S. The human genome

в реакции будет множество фрагментов,

различающихся по длине, так как синтез их

project and its impact in medicine. European

Review 4 4: 415-426, 1996.

начинается с фиксированной точки (от

Birnstiel M.L. Gene therapy. European Review 4 4:

праймера), а кончается в положении одного

335-356, 1996.

из нуклеотидов,

соответствующему

Birnstiel M.L. The genetic revolution 1950-1996: an

дидезоксинуклеотида. В электрофорезе они

introduction. European Review 4 4: 333-334,

разделяются и последовательность легко

1996.

определяется (Рис. 7.26).

Lewin B. Genes. Oxford, New York, Tokyo; Oxford

University Press, 633-656, 1994.

Литература к разделу 7.4.9.

Murrey N.E. Gene cloning. European Review 4 4:

Russell, P.J. Genetics, Fifth edition. Addison Wesley

357-370, 1996.

Russell, P.J. Genetics Fifth edition. Addison Wesley

Longman, Ins, Menlo Park, California, 473-

Longman, Ins, Menlo Park, California, 479-

476, 1998.

493, 1998.

7.4.10. Применение

SibiliaM.,WagnerE.F.Transgenicanimals.European

Review 4 4: 371-391, 1996.

технологий с использованием

Shizuyer H., Birren B., Kim U.-J., Mancino V.,

рекомбинантной ДНК

Slepak T., Tachiiri Y., Simon M. Cloning and

С начала 1970х годов, когда появилась

stable maintenance of 300-kilobase-pair

первая публикация о получении in vitro

fragments of human DNA in Escherichia coli

рекомбинантной ДНК, возникла новая наука

using an F-factor-based vector. Proc. Natl

– генная инженерия. Основные направления

Acad. Sci. USA 89: 8794-8797, 1992.

Strachan T., Read A.P. Human Molecular Genetics.

–созданиетрансгенныхживотныхирастений,

иразработкапринциповгеннойтерапии.

Bios Scientific Publishers limited. Oxford, 96-

106, 1996.

Литература к разделу 7.4.10.

Walden R., Maas C., Martini N., Schell J. Transgenic

plants. European Review 4 4: 393-414, 1996.

Алиханян С.И., Акифьев А.П., Чернин Л.С.

Общая генетика. Москва, Высшая школа,

7.4.11. Трансформация у

411-426, 1985.

дрозофилы

Глеба Ю.Ю. Биотехнология

растений.

Соросовский образовательный журнал

Трансформацией в генетике называют

6: 3-8, 1998.

перенос генов из одного организма в другой.

Глава 7

Структура гена

ТрансформацииупрокариотпосвященРаздел

Рисунок 7.27

5.10.

Уэукариоттрансформациявприродедо

сих пор не обнаружена. Что же касается

экспериментальной передачи ДНК из одной

клеткивдругую,тонапротяжениимногихлет

она у исследователей не получалась. Многие

группыученыхазартноконкурировалидругс

другом в конце 1970-х - начале 1980-х годов,

пытаясьпервымиосуществитьпереносДНК.

Успехибыливесьмаредкими:молекулыДНК,

инъецированныемикрохирургическивранние

эмбрионынекоторыхвидовмлекопитающих,

амфибий,морскихежей,иногдавстраиваются

в хромосомы клетки-хозяина. У дрозофилы

искусственно введенная ДНК почти не

включается в хромосомы эмбриона, хотя в

Джеральд Рубин

культуреклетоктипичнаятрансформация(или

ðîä. 1950

как говорят, трансфекция) происходит

довольно часто. Однако, очевидно, что из

Рисунок 7.28

такой клетки трудно получить целый

организм, и трансформированная ДНК не

может передаваться потомству.

В конце концов повезло двум

американским исследователям Дж. Рубину и

А. Спрадлингу (Рис. 7.27 и 7.28) в 1982 году.

Для переноса ДНК они использовали

мобильный P-элемент. Для осуществления

транспозиции у Р-элемента существуют

специальноустроенныеструктуры-концевые

повторы - по 150 п.н. определенной

последовательностинакаждомконцеэлемента,

совершенно необходимые для перемещений.

Именно с этими участками связывается

транспозаза и

катализирует процесс

встраивания-вырезания Р-элемента. Таким

Аллан Спрадлинг

образом, для нормального перемещения Р-

ðîä. 1949

элемента нужно, чтобы были выполнены два

условия: наличие у него неповрежденных

легко компенсирован, если в геноме

концевыхповторовинормальнаяактивность

присутствуетещеодинР-элемент,нормальный,

транспозазы.Еслибудетнарушенкакой-либо

которыйиобеспечитналичиетранспозазы.

из экзонов гена транспозазы или во время

Учитывая все перечисленное выше,

транскрипции и созревания матричной РНК

экспериментпотрансформацииудрозофилы

транспозазынебудетудаленодинизинтронов,

схематическивыглядитследующимобразом:

полноценного фермента транспозазы не

готовят ДНК двух Р-элементов, один из

получится, и Р-элемент не будет

которыхможетсинтезироватьтранспозазу,но

перемещаться.

Однако, недостаток

не способен встраиваться в геном, так как у

транспозазыизодногоР-элементаможетбыть

негоповрежденодинизконцевых(с3’-конца)