Подготовка у универсиаде 2012 / Генетика (Жимулев) / 7-2ver7

Структура гена

Челночный вектор YEp24 между клетками E. coli и дрожжей. Показаны уникальные сайты рестрикöèè (Èç: Russell, 1998, p.457).

маркеры ampR è tetR (E. coli), а также URA3 (контроль биосинтеза урацила для клеток дрожжей), последовательность, специфичную для дрожжей - плазмиду 2 circle, позволяющую реплицироваться автономно в дрожжевой клетке.

Таким образом, YEp24 способна реплицироваться как в клетках дрожжей, так и E. coli.

7.4.2.5. Искусственные хромосомы дрожжей (YAC)

Векторы этого типа имеют следующие характеристики: 1. Теломеры на каждом конце;2.Центромерныепоследовательности (CEN); 3. Селекционные маркеры на каждом плече (TRP1 и URA3 - независимость от наличия триптофана и урацила, соответственно); 4. Автономно реплицирующиеся последовательности - ARS, позволяющие реплицироваться в дрожжевой клетке; 5. Рестрикционные сайты, уникальные для участков YAC, и пригодные для инсерций ДНК (Рис. 7.15).

Клоны вводятся в клетки дрожжей трансформацией.ОтбираяпомаркерамTRP1 и URA3, можно быть уверенным, что инсерцияДНКимеетилевое,иправоеплечо. Размеры клонируемых последовательностей

Литература к разделу 7.4.2.

Алиханян С.И., Акифьев А.П., Чернин Л.С. Общая генетика. Москва, Высшая школа, 420-425, 1985.

Russell, P.J. Genetics Fifth edition. Addison Wesley Longman, Ins, Menlo Park, California, 454455, 1998.

7.4.3. Cоздание геномных библиотек

Коллекцияклонов,содержащаяхотябы поодномуэкземплярукаждогоизфраментов ДНК,входящихвсоставгеномаданноговида, называетсягеномнойбиблиотекой.

Аналогичныеколлекции,полученныеиз индивидуальных хромосом или их частей, называютхромосомнымибиблиотеками.

Получение геномных библиотек включает выделение тотальной ДНК, фрагментацию ее с помощью рестриктаз, присоединение полученных фрагментов к векторным молекулам (плазмидного или фагового происхождения) и введение рекомбинантных ДНК в реципиентные бактерии.Известнотриподхода,применяемых присозданиигеномныхбиблиотек:

1.Геномная ДНК полностью переваривается рестриктазой и затем заключается в клонирующий вектор. Недостатком этого методаявляетсято,чторазмерыклонируемых инсерцийдовольномалы,около4т.п.н.

2.ДНК фрагментируется механическими воздействиями (пропускание через иглу шприца, обработка ультразвуком), что позволяетполучитьболеекрупныефрагменты -20-150т.п.н.,однакоиз-заотсутствиялипких

Структура гена

Рисунок 7.18

Вектор

Клонирование фрагментов кДНК с использованием линкеров, содержащих сайт рестрикцииBamHI(Из:Russell,1998,p.463).

èвыделяют клоны, заключенные в λ фагах (Рис. 7.19). Сначала выращивают газон бактерий E. coli, на который помещают суспензию фагов, содержащих геномные клоны.Втехучастках,гдефагиинфицировали бактерийиразмножились,образуетсябляшка (plaque), т.е. как бы дырка на поверхности газона E. coli. Каждая бляшка состоит из большогочислапотомководиночнойфаговой частицы,размножившихсявинфицированных

èлизированныхбактериях.Всякийраз,когда бактерия лизируется, освобождаются не только упакованные фаговые частицы, но и неупакованнаяфаговаяДНК.

Мембранныйфильтркладутнаэтотгазон

на несколько минут, в результате чего ДНК из

Глава 7

бляшкисвязываетсясфильтром.Последующая обработка фильтра щелочным раствором приводиткденатурацииДНКнаодиночныенити. После этого фильтры инкубируют с меченым зондом. Гибридизация меченого зонда с ДНК из бляшки выявляется в виде темного пятна засветки на фотопленке. По положению засвеченногопятнанаходятположениебляшки нагазоне.Фагисэтойбляшкиможнособратьи, инфицировав новые бактерии, размножить фагов, а следовательно и клон до количеств, необходимыхдлямолекулярногоанализа.

Литература к разделу 7.4.3.

Russell, P.J. Genetics Fifth edition. Addison Wesley Longman, Ins, Menlo Park, California, 460468, 1998.

7.4.4. Построение рестрикционных карт

Поскольку клонированные последовательностиДНКпредставляютсобой гомогенную популяцию молекул ДНК, расщепление их с помощью рестриктаз приводит к образованию более мелких дискретных фрагментов. С помощью специального анализа можно определить расположениерестрикционныхфрагментовв молекулеДНК,т.е.построитьрестрикционную карту.

Существует несколько способов построения рестрикционных карт. Для того, чтобы получить точную, детальную и полезнуюдляработыкарту,чащевсегонельзя ограничиться только одним из них. Наиболее употребительными являются следующие способы:

1)одновременное расщепление ДНК несколькимирестриктазами.

2)последовательное расщепление выделенного рестрикционного фрагмента второйрестриктазой.

3)частичноерасщеплениенемеченойДНКили ДНК,меченойпоодномуконцу.

4)частичное расщепление ДНК экзонуклеазамиспоследующимрасщеплением рестриктазой.

Мембрана с фаговой ДНК

Гибрид

фаговой

ÄÍÊ ñ Фотопленка радиоактивным

зондом

Получение отпечатков фаговой ДНК на мембране

Отмывка мембраны, денатурация ДНК и гибридизация с радиоактивно

мечеными зондами (красный цвет)

Какой из этих методов использовать в каждомконкретномслучае,зависитотмногих причин. По размерам образующихся фрагментов ДНК удается определить относительное местоположение по крайней мере некоторых участков расщепления. С увеличением числа парных комбинаций ферментовувеличиваетсячислоопределенных участковвплотьдополученияокончательной картины... В результате получается карта рестрикционныхсайтов.

На Рис. 7.20 представлен простейший пример рестрикционного картирования. Допустим,чтобылклонированфрагментДНК длиной 5 т.п.н. Теперь одну аликвоту ДНК режут рестриктазой EcoRI, другую - BamHI, третью - смесью обеих рестриктаз. После электрофоретическогоразделенияфрагментов можноопределитьихразмеры, сопоставляяс размерами известных фрагментов ДНК (маркеры размеров ДНК). После электрофореза гель красят бромидом этидия

èфотографируют в ультрафиолетовом свете. На фотографиях измеряют расстояния, пройденные тем или иным фрагментом от старта. Для маркеров молекулярный размер каждого фрагмента известен, равно как и расстояние, пройденное со старта. Поэтому легко составить калибровочную кривую. Затем на этой кривой находят положение каждогофрагментаподлинепройденногопути

èопределяют размер. В конкретном случае, изображенном на Рис. 7.20, очевидно, что после обработки EcoRI появляются два фрагмента4.5и0.5т.п.н.,этосвидетельствует о наличии только одного сайта рестрикции и этот сайт находится на 0.5 т.п.н. от одного из концов исходного фрагмента. По этой же логикеестьтолькоодинрестрикционныйсайт BamHI, локализованный на 2 т.п.н. от одного из концов. При совместномгидролизе двумя рестриктазамиполучаютсятрифрагмента:2.5, 2.0 и 0.5 т.п.н. Расположить эти фрагменты непротиворечивосданными,полученнымипри действиикаждойизрестриктазвотдельности, можно лишь так, как нарисовано на окончательной рестрикционной карте (Рис. 7.20).

В реальных экспериментах построение рестрикционных карт - значительно более сложныйпрцесс.

Литература к разделу 7.4.4.

Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Москва, Мир, 337-338, 1984.

Russell, P.J. Genetics Fifth edition. Addison Wesley Longman,Ins,MenloPark,California,469-471, 1998.

7.4.5. Саузерн-блот анализ

Для картирования хромосомных перестроекнафизическойкарте,определения положения гена, выявления повторов, хромосомной ходьбы и т.д. используется Саузерн-блот анализ, изобретенный Э. Саузерном в 1975 г. Для разделения фрагментов ДНК обычно используют электрофорез в агарозном геле. Для облегчения процедур с молекулами, находящимися в геле, применяют метод Саузерн-блот. ДНК в геле денатурируют, и к гелю прикладывают нитроцеллюлозный фильтр. ДНК переносится на фильтр, где фиксируется обработкой высокой температурой или ультрафиолетом. Эта процедура напоминает прикладывание промокательной бумаги к тексту с еще не высохшимичернилами(по-английскиblotting - промокание). После ряда дополнительных процедур все фракции ДНК, разделившиеся

âгеле в результате электрофореза, оказались перенесенныминафильтр(Рис.7.21). Фильтр затем помещают в гибридизационныйбуфер,

âкотором находится зонд, меченый радиоактивным изотопом или химическим путем.Этотзондсвяжетсяскомплементарным участком ДНК. После промывки фильтра можноприступитьквыявлениюсигнала.Если зонд был радиоактивным, к фильтру прикладывают рентгеновскую пленку и выявляют участок засветки. Если зонд мечен с помощью химических модификаторов, то детекцию проводят с фильтром и на нем же выявляютсигнал.

ПримериспользованияСаузерн-блотов представленынаРис.7.22.

Клонированные линейные фрагменты ДНК длиной 5 т.п.н.

Разрезание рестриктазами и электрофорез в агарозном геле

Длинные _ фрагменты

Короткие фрагменты +

BamHI

EcoRI+

ò.ï.í.

5.0

4.5

3.0

2.5

2.0

0.5

Размеры фрагментов

Построение

калибровочной кривой по длине маркерных фрагментов и определение длины анализируемых фрагментов

Построение

рестрикционной

карты

Длина фрагментов (в т.п.н.)

Длина пробега

Литература к разделу 7.4.5.

Russell, P.J. Genetics Fifth edition. Addison Wesley Longman, Ins, Menlo Park, California, 471, 1998.

7.4.6. “Хромосомная ходьба”

Процесс клонирования с помощью метода т.н. “хромосомной ходьбы” (walking), предложенного в 1979 году В. Бендером, П. Спирером и Д. Хогнесом, позволяетполучать длинные тракты ДНК. Для начала “ходьбы” нуженспецифическийзонд,т.е.фрагментДНК изданногорайонахромосомы;этоможетбыть ДНКгена,илиДНКР-элементаприусловии,что вследствие его инсерции в клонируемом гене индуцированамутация.

Таким образом “ходьба” - это процесс идентификацииприлежащихклоноввгеномной библиотеке.

Процесс“ходьбы”включаетследующие этапы:

1.Получениеисходногозонда;

2.Поисквгеномныхбиблиотеках;

3.Выделениеклонаипостроение

рестрикционнойкарты; 4.Выделениеновогозондаиновый поиск

вбиблиотеках.

ПервоначальныйклонДНКдолженбыть каким-тоспособомполучен.Меченыйконцевой кусок этого клона (правый на рис. 7.23) используют для скринирования библиотеки,

сделанной на основе λ -фага или космид, и отбирают все рекомбинантные фаги. Как правило,отбираетсянесколькофагов(а-гнаРис. 7.23). Поэтому, чтобы задать нужное направление движения при ходьбе, все полученные клоны проверяют на наличие гомологии с одним из ближайших к концу клонов-1'.

Отбираюттолькотерекомбинантныефаги, которыесодержатклоны,гибридизующиесяс концевым фрагментом 1, но не с фрагментом 1'.Затемстроятрестрикционнуюкартуклона“г” ивновьотбираютдваконцевыхфрагмента-2и 2'. Используя клон 2 как зонд, скринируют библиотеку. Из вновь полученных клонов отбирают только те, которые не имеют гомологии с фрагментом 2', т.е. клон “д” (Рис. 7.23).Затемвсеповторяют сфрагментами3и 3', и т.д. С помощью “ходьбы” клонируют протяженные участки хромосомной ДНК. Известен случай, когда из генома дрозофилы клонировалидо800т.п.н.

Изограниченийметодаможноуказатьна огромные сложности клонирования в случае если ДНК зонда является повторенной, и гомологичнаязондуДНКразбросанапогеному. В этом случае можно первый шаг сделать в одном участке хромосомы,а второй уже в другом, там где локализована данная повторенная ДНК. Вторым ограничением являетсянебольшаядлинакаждогошага.

хромосомычеловеканесутгомологичныйген, находящийсявнихвдвухаллельныхсостояниях. Этот ген кодирует компонент зубной эмали - амелогенин, в Y хромосоме он на 6 пар нуклеотидовдлиннее,чемвXхромосоме.Для того, чтобы выявить, содержится ли в данном образцеДНКизYхромосомы,извсейгеномной ДНК анализировали лишь область амелогенинового гена, содержащую участок, различный в X и Y хромосомах. Размер этой областисоставляетоднутридцатимиллионную долю от всего генома.

Для определения размера полученных ПЦР-фрагментов их разделяют с помощью электрофореза в агарозном геле. На Рис. 7.25

показаны результаты такого разделения фрагментов гена амелогенина после проведения ПЦР на ДНК из костных останков.

На девяти дорожках справа - фрагменты, полученные на ДНК из костных останков. Слева - две дорожки с контрольными образцами: фрагментами, синтезированными на геномной ДНК, выделенной из крови мужчины и женщины. УДополнениемужчин образуется7.5 два фрагмента: длиной

В 1993 году К.Б. Мюллис (K.B.Mullis) получил Нобелевскую премию за разработку метода полимеразной цепной реакции.