Введение

Актуальность проблемы. Снижение функциональных возможностей мозга, в том числе способности к обучению и памяти, рост вероятности развития нейродегенеративных заболеваний - неизбежные проявления старения, критический возраст манифестации и масштабы которых существенно различаются. Актуальность выяснения причин раннего старения мозга и поиск способов его профилактики приобрели особую актуальность в связи с постарением населения развитых стран. Механизмы старения и патогенез связанных с ним нейродегенеративных заболеваний тесно связаны с окислительным стрессом – нарушением баланса в системах генерации и детоксикации активных форм кислорода (АФК). Вероятность его развития с возрастом растет вследствие усиления образования АФК и/или снижения способности клеток к их нейтрализации. Это приводит к накоплению в клетках мозга окислительных повреждений макромолекул, способных приводить к деполяризации мембран нейронов, изменению порога их чувствительности к действию нейромедиаторов, к нарушению оптимальных условий функционирования рецепторов, транспортных и сигнальных систем и, как следствие, к нарушению функций мозга, в том числе – способности к обучению, памяти [Droge W., 2002; Valko M. et al., 2007; Gerich F.J. et al., 2009]. Стрессы, неблагопpиятные воздействия среды, неполноценное питание, заболевания, активирующие свободнорадикальные процессы, способствуют раннему старению организма [Mattson M.P., 2001]. Закономерно со времен формулировки Д.Харманом [1958] свободнорадикальной теории старения в качестве геропротекторов используют антиоксиданты, приём которых нацелен на длительное применение в молодом и зрелом возрасте. Доказана способность антиоксидантов замедлять развитие возрастных изменений мозга, проявлений таких нейродегенеративных заболеваний, как болезни Альцгеймера и Паркинсона [Navarro А. et al., 2005]. В то же время в последние годы существенно расширились представления об участии АФК в физиологических процессах. Они не только участвуют в метаболизме клеток в качестве промежуточных продуктов синтеза и обеспечивают микробицидность фагоцитирующих клеток. Как сигнальные молекулы АФК регулируют многие физиологические процессы, запускают клеточный ответ, направленный на мобилизацию функциональных резервов, участвуют в процессах нейрональной пластичности [Hu H.J. et al., 2007]. В этой связи целесообразность подавления свободных процессов в организме, особенно здоровом, уже не представляется абсолютно бесспорной. Поднимается вопрос о том, что необоснованные добавки антиоксидантов могут принести больше вреда, чем пользы. В этом убеждают результаты недавних эпидемиологических исследований, показавших, что на фоне длительного приёма больших доз антиоксидантов растет вероятность развития ряда ассоциированных со старением заболеваний [Evans J., 2008; Dotan Y. et al., 2009; Jonson E.J., 2010]. Тем не менее, количество новых препаратов со свойствами антиоксидантов растет. Объективную оценку их эффективности затрудняют индивидуальные особенности развития возрастных дисфункций, различия в характере питания и базовой обеспеченности людей антиоксидантами.

Объективно оценить эффективность терапевтических воздействий позволяют биологические модели. До недавнего времени единственной общепризнанной моделью преждевременного старения была линия мышей SAMP (senescence-prone accelerated mice), сублинии которой различаются по ряду характеристик, в том числе - по характеру расстройств эмоциональной сферы, природе нарушений когнитивных функций [Takeda Т.,1998, 2009]. В последние годы получены убедительные аргументы в пользу того, что уникальной моделью для изучения механизмов старения может служить созданная в Институте цитологии и генетики СО РАН линия преждевременно стареющих крыс OXYS. Линия создана селекцией и инбридингом крыс Вистар, чувствительных к катарактогенному эффекту галактозы [Соловьёва Н.А. и др., 1975]. В 5 первых поколениях развитие катаракты провоцировали нагрузкой галактозой, в дальнейшем проводился отбор по ранней спонтанной катаракте, сцеплено с которой животные унаследовали синдром преждевременного старения. Помимо катаракты он проявляется снижением максимальной продолжительности жизни и ранним развитием ассоциированных со старением заболеваний: ретинопатии, остеопороза и артериальной гипертензии [Колосова Н.Г. и др., 2003; Муралева Н.А. и др., 2010; Bobko А.А. et al., 2005]. Одно из ранних проявлений старения мозга у людей и животных - нарушение краткосрочной памяти [Huppert F.A., 1991]. К моменту постановки задач настоящего исследования её снижение, а также снижение поисково-исследовательской активности и повышенная тревожность были выявлены у трёхмесячных крыс OXYS [Лоскутова Л.В., Колосова Н.Г., 2000]. Оставалось не ясным, проявляются эти признаки у крыс OXYS с рождения, развиваются в связи с изменениями зрительной функции или становятся проявлениями ускоренного старения мозга. Всесторонняя характеристика линии крыс OXYS как потенциальной модели ускоренного старения мозга позволит использовать этих животных для исследования его механизмов и оценки эффективности терапевтических воздействий, в том числе – длительного приёма антиоксидантов. Наряду с традиционными антиоксидантами – витамином Е [Halliwell В., 2006] и обладающими высокой антирадикальной активностью флавоноидами черники [Costantino L. et al., 1992; Joseph J.A. et al., 1999] в работе оценивались эффекты соединений принципиально нового класса – антиоксидантов, способных проникать и накапливаться в митохондриях: убихинон-децил-трифенилфосфония [МitoQ, Murphy M.P., 2001] и пластохинонил-децил-трифенилфосфония [SkQ1, Скулачев В.П., 2007].

Целью работы явилось исследование возрастных изменений поведения крыс OXYS с признаками преждевременного старения и крыс Вистар с нормальным темпом старения и оценка возможности влиять на них с помощью антиоксидантов. При этом были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить динамику возрастных изменений поведения крыс OXYS с признаками преждевременного старения и крыс Вистар с нормальным темпом старения в серии поведенческих тестов:

а) тревожного поведения в приподнятом крестообразном лабиринте;

б) моторно-исследовательского поведения в тесте «открытое поле»;

в) пространственной памяти в водном тесте Морриса.

2. Изучить структурно-функциональные характеристики головного мозга крыс OXYS с признаками преждевременного старения разного возраста методами магнитно-резонансной томографии.

3. Исследовать возможную связь изменений поведения крыс OXYS с развитием катаракты и ретинопатии и вызванными ими нарушениями зрительной функции.

4. Оценить влияние на поисково-исследовательскую активность и тревожность крыс OXYS с признаками преждевременного старения и Вистар с нормальным темпом старения профилактического приема антиоксидантов: витамина Е, флавоноидов черники и адресованных в митохондрии антиоксидантов SkQ1 и MitoQ.

5. Оценить влияние SkQ1 на двигательную, исследовательскую активность, тревожность и способность к пространственной памяти крыс OXYS и Вистар с выраженным возрастным снижением этих показателей.

Научная новизна работы. В работе впервые дана характеристика линии крыс OXYS как модели для исследования механизмов ускоренного старения мозга. Показано, что у крыс OXYS, как и у крыс Вистар, с возрастом двигательная и исследовательская активность снижается, а тревожность растет, но ускоренными темпами. Установлено, что повышенный уровень тревожности и сниженная двигательная и исследовательская активность развиваются у крыс OXYS к возрасту 3 месяцев, нарушения пространственной памяти – к возрасту 12-14 и не являются врожденными, а развиваются на фоне нейродегенеративных изменений мозга. Развитие катаракты и дистрофии сетчатки оказывают влияние на поведение крыс OXYS, но его характер зависит от возраста и выраженности патологических изменений. В возрасте 3 мес. у крыс OXYS отсутствует связь между поисково-исследовательской активностью и выраженностью патологических изменений сетчатки и хрусталиков. Начиная с возраста 12 мес., напротив, крысы OXYS с выраженными патологическими изменениями, предполагающими нарушение зрительной функции, демонстрируют более высокую тревожность и пассивный характер поведения.

Впервые выявлена способность антиоксидантов: витамина Е, флавоноидов черники, адресованных в митохондрии антиоксидантов MitoQ и SkQ1 – изменять уровень тревожности и влиять на поисково-исследовательскую активность молодых животных. Показано, что длительный профилактический приём SkQ1 (с 1,5 до 12 мес.) замедлил снижение способности к обучению, но при этом повысил тревожность крыс OXYS. Не изменив тревожность, SkQ1 предупредил снижение поисково-исследовательской активности у крыс Вистар. Выявлена способность SkQ1 (приём с 12 до 15 мес.) повышать до уровня молодых животных поисково-исследовательскую активность и снижать тревожность у крыс Вистар и OXYS с выраженными возрастными изменениями поведения. Впервые установлено, что эффекты антиоксидантов зависят от генотипа, возраста животных, дозы и длительности приёма.

Практическая значимость работы определяется доказательством соответствия линии крыс OXYS критериям модели ускоренного старения мозга, возможности её использования для исследования этиологии и патогенеза связанных со старением нейродегенеративных процессов, в том числе на ранних доклинических стадиях их развития, а также для корректной оценки эффективности терапевтических воздействий, направленных на лечение и профилактику возрастных изменений мозга. Выявленные в работе эффекты витамина Е, флавоноидов черники, MitoQ и SkQ1 на крыс OXYS и Вистар расширяют представления о диапазоне возможных эффектов антиоксидантов, демонстрируют необходимость всесторонней оценки последствий их длительного приёма с учётом возможных неоднозначных эффектов на поведение и эмоциональное состояние организма.

Положения, выносимые на защиту

1. Повышенный уровень тревожности, сниженная двигательная и исследовательская активность, нарушение пространственной памяти у крыс OXYS не являются врожденными, а становятся проявлениями их преждевременного старения и развиваются на фоне нейродегенеративных изменений мозга.

2. Линия крыс OXYS - адекватная модель ускоренного старения мозга и может использоваться для исследования его механизмов и оценки эффективности терапевтических воздействий.

3. Антиоксиданты влияют на поведенческий стереотип и уровень тревожности животных, их эффекты зависят от генотипа, возраста, дозы и длительности приёма.

Апробация результатов

Полученные результаты были представлены и обсуждены на: 3th International Conference «Basic science for medicine», Novosibirsk, 2007; ХХ и ХХI съезде физиологического общества им. И.П.Павлова, Москва, 2007 и Калуга, 2010; 5-й и 6-й национальной конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», Смоленск, 2007, 2009; 1-й и 2-й конференции «Ионы Скулачева», Москва, 2007 и Суздаль, 2008;.VI Физиологическом съезде, Барнаул, 2008; IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008; Втором Международном форуме по нанотехнологиям, Москва, 2009 г; International Workshop «From Homo sapiens to Homo sapiens liberates», MSU, Москва, 2010; Международной конференции в честь 75-летия со дня рождения директора НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского декана Факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В.Ломоносова профессора В.П.Скулачева «Bioenergetics: from the past till the present – how to make Homo sapiens liberates», Москва, 2010; 6-й международной крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии», 2010, г. Судак, Украина; 1-й международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», Санкт-Петербург, 2010.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 11 статей в рецензируемых журналах и глава в монографии.

Структура и объем работы

Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы (285 наименования). Работа изложена на 137 страницах, содержит 16 рисунков и 3 таблицы.