Занятие №18
.pdfГБОУ ВПО “Уральская государственная медицинская академия” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии
Методические указания №18 к практическим занятиям для студентов
ООП специальности 060101.65 Лечебное дело Дисциплина С2.Б.10 Микробиология, вирусология
1.Тема: Лабораторная диагностика кишечных инфекций. Возбудитель холеры.
2.Цели занятия: Изучить со студентами методы лабораторной диагностики кишечных инфекций, свойства возбудителя холеры, факторы патогенности и патогенез холеры, клинические проявления, методы диагностики, профилактики и лечения холеры.
3.Задачи занятия:
3.1.Изучение методов лабораторной диагностики кишечных инфекций.
3.2.Изучение свойств холерного вибриона.
3.3.Изучение факторов патогенности и патогенеза холеры.
3.4.Изучение методов диагностики, профилактики и лечения холеры.
3.5.Выполнение самостоятельной работы.
Шифр |
Содержание |
знать |
уметь |
владеть |
|
компетенции |
|
|
|
ПК-7 |
Способность и |
Морфологические, |
Готовить мазки и |
Техникой посева |
|
готовность |
культуральные, |
окрашивать их по |
материала на плотные |
|
применять методы |
биохимические |
Граму |
и в жидкие |
|
асептики и |
свойства холерного |
|
питательные среды |
|
антисептики, |
вибриона |
|
|
|
использовать |
|
|
|
|
медицинский |
|
|
|
|
инструментарий, |
|
|
|
|
проводить |
|
|
|
|
санитарную |
|
|
|
|
обработку лечебных |
|
|
|
|
и диагностических |
|
|
|
|
помещений |
|
|
|
|
медицинских |
|
|
|
|
организаций, |
|
|
|
|
владеть техникой |
|
|
|
|
ухода за больными |
|
|
|
ПК-20 |
Способность и |
Методы |
Пользоваться |
Техникой посева |
|
готовность |
профилактики и |
бактериологическим |
материала на плотные |
|
назначать больным |
лечения холеры |
инструментарием и |
и в жидкие |
|
адекватное |
|
микроскопом |
питательные среды |
|
(терапевтическое и |
|
|
|
|
хирургическое) |
|
|
|
|
лечение в |
|
|
|
|
соответствии с |
|
|
|
2
|
выставленным |
|
|
|
|
диагнозом, |
|
|
|
|
осуществлять |
|
|
|
|
алгоритм выбора |
|
|
|
|
медикаментозной и |
|
|
|
|
немедикаментозной |
|
|
|
|
терапии больным с |
|
|
|
|
инфекционными и |
|
|
|
|
неинфекционными |
|
|
|
|
заболеваниями, к |
|
|
|
|
ведению |
|
|
|
|
физиологической |
|
|
|
|
беременности, |
|
|
|
|
приему родов |
|
|
|
ПК-31 |
Способность и |
Методы |
Работать с учебной |
Медико- |
|
готовность изучать |
лабораторной |
и научной |
биологическим |
|
научно- |
диагностики |
литературой |
понятийным |
|
медицинскую |
кишечных |
|
аппаратом |
|
информацию, |
инфекций |
|
|
|
отечественный и |
|
|
|
|
зарубежный опыт |
|
|
|
|
по тематике |
|
|
|
|
исследования |
|
|
|
4.Продолжительность занятия в академических часах: 3 часа.
5.Контрольные вопросы по теме:
5.1.Методы лабораторной диагностики кишечных инфекций.
5.2.Морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические свойства холерного вибриона.
5.3.Факторы патогенности возбудителя и патогенез холеры.
5.4.Методы диагностики, профилактики и лечения холеры.
6. Задания и методические указания к их выполнению.
На занятии студенту необходимо выполнить:
6.1.Ответить на вопросы преподавателя.
6.2.Принять участие в обсуждении изучаемых вопросов.
6.3.Выполнить самостоятельную работу.
Теоретическая справка
I. Лабораторная диагностика кишечных инфекций
Лабораторная диагностика кишечных инфекций регламентирована санитарно-эпидемиологическими правилами СП 3.1.1.1117-02 “Профилактика кишечных инфекций”. В соответствии с этими правилами лабораторному обследованию подлежат лица с подозрением на острые кишечные инфекции, лица, контактировавшие с больными, работники отдельных профессий, производств и организаций при поступлении на работу и по эпидемическим показаниям, секционный материал при наличии прижизненного диагноза острой кишечной инфекции (ОКИ).
3
В качестве исследуемого материала для лабораторной диагностики используют фекалии, кровь, рвотные массы, промывные воды желудка, остатки пищевых продуктов. Материал для лабораторного исследования собирают в стерильную стеклянную посуду. Срок доставки материала в лабораторию не должен превышать 2 часов. При невозможности своевременной доставки материала в лабораторию используют консервант или транспортную среду. При этом материал помещается в холодильник и направляется на исследование не позднее 12 часов после сбора.
Лабораторная диагностика кишечных инфекций включает в себя получение чистой культуры возбудителя, изучение ее морфологических и тинкториальных свойств, биохимической активности, фагочувствительности, серологических характеристик. Для этого на 1-ом этапе исследования производят посев культуры на дифференциально-диагностические питательные среды (Эндо, Левина, Плоскирева, висмут-сульфитный агар). На 2-ом этапе проводят выделение чистой культуры (пересев на скошенный МПА, среду Олькеницкого). На 3-ем этапе проводят идентификацию выделенной культуры по микроскопической картине, биохимической активности, серологическим свойствам (в реакции агглютинации). На 4-ом этапе учитывают результаты исследования и выдают заключение.
Для этиологической расшифровки ОКИ дополнительно в качестве вспомогательных могут быть использованы люминесцентный, молекулярногенетический и другие методы.
Транспортные среды для энтеробактерий:
1.Физраствор.
2.Глицериновый раствор (консервант) или буфер.
3.Фосфатно-буферный раствор.
4.Среда Эймса (соли, агар, уголь) без угля.
5.Среда Кери-Блейра (соли и агар).
6.Среда Стюарта.
Среды для выделения и идентификации энтеробактерий (рекомендованы ВОЗ, 1990):
1.Базовые среды: - кровяной агар;
- агар на переваре сои.
2.Селективные и дифференциально-диагностические среды: - ацетатный агар; - пептонная вода с Андреде; - среда Клиглера; - агар Мак-Конки;
- SS-агар;
- цитратный агар Сименса.
Среда Клиглера (2 сахара – глюкоза и лактоза) позволяет судить о
ферментации углеводов, образовании сероводорода (среда чернеет) и образовании газа (разрыв среды).
Трехсахарный агар по Олькеницкому (сахароза, глюкоза, лактоза,
мочевина, соли) позволяет судить о продукции уреазы (красный цвет), ферментации
4
сахаров (желтый цвет), продукции сероводорода (черный цвет), образовании газа (разрыв среды).
Сахаролитические свойства (ферментация углеводов):
1.Среды Гисса – 1% пептонная вода + 0,5% углевода + индикатор Андреде (кислый фуксин в 1 н. растворе NaOH). Среда бесцветная, рН 7,2-7,4. при ферментации углевода – красный цвет.
2.Полужидкие среды с углеводами и индикатором ВР (смесь водного голубого и розоловой кислоты). Нейтральный рН – среда бесцветная; кислая среда – синяя окраска; щелочная среда – красная окраска.
3.Короткий пестрый ряд – среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой, маннитом.
Протеолитические свойства:
1.Разжижение 10-20% желатины.
2.Образование аммиака в пептонной воде (посинение розовой лакмусовой
бумаги).
3.Образование индола:
- способ Эрлиха: в пробирку с культурой добавляют 2-3 мл эфира и реактив Эрлиха (спиртовый раствор параметиламидобензальдегида с хлористоводородной кислотой). При наличии индола отмечается розовое окрашивание;
- реактив Ковача (изоамиловый спирт + диметиламинобензальдегид + серная кислота) → красный цвет;
- индикаторная бумажка, пропитанная щавелевой кислотой (способ Мореля)
→окрашивание бумаги в розовый цвет.
4.Образование сероводорода:
–среда со смесью солей (сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия) – почернение агара;
- индикаторная бумажка с ацетатом свинца → черный цвет.
Дифференциально-диагностические среды:
1.Среда Эндо (МПА + лактоза + фуксин + сульфит натрия) – бледно-розовый цвет. Разложение лактозы → образование ацетилальдегида → кислая рН → взаимодействие с сульфитом натрия → восстановление фуксина → красное окрашивание колоний (с металлическим блеском).
2.Среда Левина (МПА + лактоза + метиленовый синий + эозин + калия гидроортофосфат) – красно-фиолетовый цвет. Ферментация лактозы → изменение рН → колонии темно-сине-фиолетового (черного) цвета с зеленым блеском. Не ферментирующие колонии – бесцветные или розоватые.
3.Среда Плоскирева или бактоагар Ж (МПА + желчные кислоты + йод + бриллиантовый зеленый + нейтральный красный) – коричневато-красный цвет. Рост лактозоположительной кишечной палочки → изменение рН → колонии брусничного цвета.
II. Возбудитель холеры
Холера – особо опасное инфекционное заболевание, вызываемое Vibrio cholerae, протекающее по типу гастроэнтерита с интоксикацией и нарушением водно-электролитного обмена. В связи с тем, что для нее характерны резко
5
выраженная способность к широкому эпидемическому распространению, тяжелое течение и высокая летальность, холера относится к числу опасных инфекций.
Историческая справка. В истории холерных эпидемий можно выделить 4 периода. I период - до 1817 г., когда холера была сосредоточена только в Восточной и Южной Азии (главным образом в Индии) и не выходила за ее пределы. II период - с 1817 г. по 1926 г. холера вышла за пределы Индии и вызвала 6 пандемий, которые унесли миллионы человеческих жизней. Например, за 1823-1926 гг. Россия пережила 57 холерных лет, в течение которых холерой переболело более 5,6 млн. человек и умерло от нее 2,14 млн. человек (около 40%). III период - с 1926 г. по 1961 г. Холера вернулась в свой основной эндемический очаг, и наступил период относительного благополучия. IV период начался в Индонезии в 1961 г. седьмой пандемией, охватившей многие страны мира. С 1961 по 1996 г. холерой в 146 странах переболело 3 943 239 человек.
Классификация возбудителя. Возбудитель холеры Vibrio cholerae был открыт в 1883 г. Р. Кохом. Вид V. cholerae относится к роду Vibrio семейству Vibrionaceae отделу Cracilicutes. В настоящее время известны следующие биотипы возбудителя холеры:
-V. cholerae О1 cholerae (классический), выделенный Р. Кохом в Гонконге в 1883 г. от больного;
-V. сholerae eltor, изолированный от мусульманских паломников в 1906 г. на карантинной станции Эль-Тор а Египте;
-V. cholerae О139 bengal, выделенный в 1993 г. в индийском штате Западная Бенгалия от больных во время крупной вспышки диарейной инфекции.
Эпидемиология. Холера - типичная кишечная инфекция. Природный резервуар и источник инфекции - больные и бактерионосители, а также вода, загрязненная их выделениями. Основной механизм передачи - фекалъно-оралъный, редко контактный. Факторы передачи - пищевые продукты, вода, объекты окружающей среды. Пути заражения - основной - через воду, используемую для питья, купания и хозяйственно-бытовых нужд, через пищу. Животные холерой не болеют.
Обильная диарея, характерная для холеры, способствует широкому распространению возбудителя в окружающей среде, прежде всего в сточных водах и
воткрытых водоемах. Человек, больной холерой, выделяет возбудителя в количестве от 100 млн. до 1 млрд. в 1 мл испражнений, вибриононоситель выделяет с испражнениями 100-100000 вибрионов в 1 мл. Продолжительность выделения холерного вибриона у бактерионосителей составляет от 7 до 42 дней.
Морфологические и тинкториальные свойства. V. cholerae представляют собой изогнутые подвижные палочки. Подвижность холерного вибриона связана с наличием одного жгутика (монотрих). Жгутик снабжён чехликом и продольным выростом, напоминающим ундулирующую мембрану. Подвижность холерных вибрионов является важным диагностическим признаком.
Палочки грамотрицательные, короткие, не образуют спор и капсул. Диаметр палочек 0,5 мкм, длина 1,5-4,0 мкм. Вибрионы хорошо окрашиваются анилиновыми красителями.
Культуральные свойства. Для выделения холерного вибриона чаще всего используют щелочной МПА. На плотных питательных средах возбудитель холеры
6
образует небольшие круглые дисковидные прозрачные колонии S-формы с ровными краями, голубоватые в проходящем свете. При посеве уколом в столбик желатина вибрион через 48-72 часа при 22-23°С вызывает воронкообразное разжижение.
В жидких средах вибрион вызывает помутнение и образование нежной голубоватой плёнки на поверхности, её края приподняты вдоль стенок пробирки; при встряхивании пленка легко разрушается и оседает на дно. На 1% пептонной щелочной воде (рН 8,6-9,0) холерный вибрион через 6-8 часов образует нежную голубоватую плёнку и умеренную муть. Пептонная вода с добавлением 0,5-1% NaCl является наилучшей средой накопления для возбудителя холеры. Оптимальная температура выращивания составляет 37°С.
Биохимические свойства. Холерные вибрионы сбраживают с образованием кислоты многие углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннит, лактозу, гликоген, крахмал и др.). Ферментация маннозы, сахарозы и арабинозы (так называемая триада Б. Хейберга) имеет диагностическое значение. Холерные вибрионы обладают плазмокоагулирующим (свёртывают плазму кролика) и фибринолитическим (разжижают свёрнутую сыворотку) свойствами, свёртывают молоко, сероводорода не образуют, восстанавливают нитраты и образуют индол.
Антигенная структура. У холерных вибрионов выделяют термостабильные О- и термолабильные Н-антигены.
По структуре О-антигена холерные вибрионы относится к группе О1 и О139. О-антиген О1-группы холерных вибрионов неоднороден и включает А, В и С компоненты, по которым и различают три серотипа - серотип Огава (АВ), серотип
Инаба (АС) и серотип Гикошима (АВС).
Фагочувствительность. Для фаготипирования V. cholerae С. Мукерджи предложил наборы бактериофагов, которые позволяют выделить среди V. cholerae 16 фаготипов. Холерный диагностический фаг ХДФ-3 избирательно лизирует холерные вибрионы классического типа, ХДФ-4 - вибрионы Эль-Тор, а ХДФ-5 лизирует вирулентные вибрионы обоих типов.
Резистентность. Холерный вибрион малоустойчив во внешней среде и плохо переносит инсоляцию и высушивание, но хорошо и долго сохраняется и даже размножается в открытых водоемах и сточных водах, богатых органическими веществами. В стоячих водоёмах возбудитель может сохраняться до 2-3 недель, в выгребных ямах - до 3-4 месяцев. Вибрион длительно сохраняется в продуктах с щелочным рН и высокой влажностью, а также на одежде и постельном белье, загрязнённых испражнениями больных. Все вибрионы очень чувствительны к действию дезинфектантов, особенно с кислым значением рН.
Холерные вибрионы в морской воде сохраняются до 47 суток, в речной воде
– от 3-5 дней до нескольких недель, в почве - от 8 дней до 3 месяцев, в свежих испражнениях - до 3 суток, на сырых овощах - 2-4 дня, на фруктах - 1-2 дня, в молоке и молочных продуктах - 5 дней. Холерные вибрионы при 80°С погибают через 5 минут, при 100°С - моментально.
Факторы патогенности:
1. Подвижность. Обладая подвижностью, вибрион преодолевает слизистый слой и вступает во взаимодействие с эпителиальными клетками кишечника.
7
2.Факторы адгезии и колонизации, с помощью которых вибрион прилипает
кмикроворсинкам и колонизирует слизистую оболочку тонкого кишечника. Адгезию вибрионов к клеткам слизистой оболочки обусловливают пили.
3.Ферменты муциназа, протеазы, нейраминидаза, лецитиназа способствуют адгезии и колонизации, так как разрушают вещества, входящие в состав слизи.
4.Экзотоксин холероген - главный фактор патогенности V. cholerae. Молекула холерогена имеет молекулярную массу 84 кД и состоит из двух фрагментов - А и В. Фрагмент В распознает рецептор энтероцита, связывается с ним и формирует внутримембранный канал для прохождения субъединицы А. Фрагмент А внутри клетки вызывает гидролиз АТФ с образованием цАМФ, в результате чего нарушается вводно-солевой обмен и отмечается гибель эпителия тонкой кишки.
5.Фактор, повышающий проницаемость капилляров.
6.Экзотоксины типа LТ, SТ и SLT.
7.Эндотоксин отвечает за общую интоксикацию организма и рвоту, угнетает фагоцитоз, снижает кровяное давление; вызывает инфекционно-токсические явления.
Патогенез. Попав в организм человека, значительная часть вибрионов погибает под действием кислой среды желудка, и лишь небольшая часть достигает тонкой кишки. Способность холерного вибриона быстро колонизировать эпителий кишечника обусловливают жгутики, муциназа (разжижает слизь и облегчает проникновение к поверхности эпителия) и нейраминидаза (обеспечивает взаимодействие с микроворсинками). После прикрепления к эпителиальным клеткам вибрионы теряют подвижность, интенсивно размножаются, колонизируя микроворсинки тонкого кишечника и одновременно вырабатывая большое количество экзотоксина-холерогена. Холероген проникает в клетки, где активируют аденилатциклазную систему, а накапливающийся цАМФ вызывает гиперсекрецию жидкости и солей из энтероцитов, что приводит к диарее и обезвоживанию организма.
Клинические проявления. Инкубационный период при холере варьирует от нескольких часов до 6 суток, чаще всего - 2-3 дня.
У большинства инфицированных лиц заболевание протекает бессимптомно, возможна лёгкая диарея. Заболевание проявляется общим недомоганием, болями в животе, рвотой и развитием выраженной диареи.
При тяжелой форме холеры у больных появляется понос, стул учащается, испражнения становятся обильными, принимают водянистый характер, утрачивают фекальный запах и имеют вид рисового отвара (мутная жидкость с плавающими в ней остатками слизи и клетками эпителия). Для холерной диареи характерно выделение значительного количества (до 10 л в сутки) водянистых бесцветных испражнений. В зависимости от степени интоксикации симптоматика может иметь характер гастроэнтерита или энтерита.
Затем присоединяется изнурительная рвота, сначала содержимым кишечника, а затем рвотные массы приобретают вид рисового отвара. Температура
убольного падает ниже нормы, кожа становится синюшной, морщинистой и холодной.
В результате обезвоживания происходит сгущение крови, развивается цианоз, кислородное голодание, резко страдает функция почек, появляются
8
судороги, больной теряет сознание и наступает смерть. Летальность от холеры во время седьмой пандемии в разных странах варьировала от 1,5% до 50%.
В тяжёлых случаях у больных резко снижается объём мочи с развитием острой почечной недостаточности. Характерна охриплость голоса или афония. Ведущие патогенетические факторы - гиповолемия и выраженные нарушения электролитного баланса, вследствие чего развиваются артериальная гипотензия, сердечная недостаточность, нарушение сознания и гипотермия. Подобное состояние определяют как холерный алгид. Характерный признак обезвоживания – “гиппократово лицо” (facies hippocratica): запавшие глаза, заострённые черты лица с резко выступающими скулами.
При отсутствии лечения летальность больных в алгидной стадии достигает 60%. Выздоровление сопровождается приобретением непродолжительной невосприимчивости. Нередко отмечают случаи повторного заражения.
Микробиологическая диагностика. Материал для исследований -
испражнения, рвотные массы, желчь, секционный материал, пищевые продукты. Материалом для исследования на вибриононосительство служат испражнения. Из объектов внешней среды чаще всего исследуют воду открытых водоемов и сточные воды.
При проведении исследований необходимо соблюдать следующие правила:
-материал следует доставлять в лабораторию не позже 2 часов после забора (так как возбудитель быстро погибает, особенно в испражнениях). При невозможности срочной доставки образцы помещают в транспортные среды (1% пептонная вода с рН 8,2-8,6);
-ёмкости для материала нельзя обеззараживать химическими веществами, так как возбудитель чувствителен даже к их следовым количествам. Все образцы помещают в герметически закрываемую транспортную тару;
-как можно быстрее произвести посев материала от больного (холерный вибрион сохраняется в испражнениях короткий срок);
-исключить возможность загрязнения и заражения окружающих объектов. Выделение культуры проводят по схеме:
-посев на пептонную воду (первую среду накопления) и на щелочной МПА;
-через 6 часов микроскопически исследуют пленку, образующуюся на пептонной воде, и проводят пересев на щелочной МПА;
-подозрительные колонии пересевают для получения чистой культуры, которую идентифицируют по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, подвижности и окончательно типируют с помощью диагностических агглютинирующих сывороток, а также с использованием холерных диагностических фагов.
Серологическая диагностика холеры имеет вспомогательный характер. С этой целью используют реакцию агглютинации, иммуноферментный или иммунофлюоресцентный методы.
Лечение больных холерой должно заключаться в восстановлении нормального водно-солевого обмена. С этой целью используют солевые растворы. Из антибактериальных препаратов применяют тетрациклиновые антибиотики, левомицетин, ко-тримоксазол.
9
Профилактика холеры включает организацию санитарно-гигиенических мероприятий, предупреждающих занос заболевания; проведение санитарнопросветительной работы среди населения; раннее выявление больных и носителей; массовое профилактическое назначение тетрациклинов в районах эпидемической опасности.
Для специфической иммунопрофилактики применяют убитые вакцины, холероген-анатоксин и энтеральная химическая бивалентная вакцина (включает анатоксин и О-антигены серотипов Инаба и Огава). Вакцинопрофилактику проводят по эпидемиологическим показаниям. В очагах холеры с профилактической целью назначают тетрациклин.
После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок проведения самостоятельной работы.
Самостоятельная работа:
1.Поставить реакцию агглютинации на стекле с неизвестной культурой и агглютинирующими дизентерийными сыворотками №1 и №2. При положительном результате реакции с сывороткой №1 провести реакцию агглютинации с использованием сыворотки Зонне.
2.Изучить демонстрационные ЭНТЕРО-тесты 1 и 2 для дифференциации кишечных бактерий.
7.Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:
Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.
8. Литература для подготовки темы:
8.1.Основная:
1.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.
2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 448 с.: ил.
3.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.: ил.
8.2.Дополнительная:
1.Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и
доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.
2.Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.
10
3. Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.
Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.
Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.