Цитология, биохимия, молбиология-2013

Рис. 9. Схема образования «псевдоузла» благодаря спариванию комплементарных участков РНК в вершине шпильки и в другом однотяжевом участке (а); пространственная модель «псевдоузла» (б)

Занятие 2. Тема: Репликация ДНК.

МАТРИЧНЫЙ СИНТЕЗ

Модель ДНК Уотсона и Крика сразу же позволила понять принцип удвоения ДНК. Поскольку каждая из цепей ДНК содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную другой цепи, т. е. их информационное содержание идентично, представлялось вполне логичным, что при удвоении ДНК цепи расходятся, а затем каждая цепь служит матрицей, на которой выстраивается комплементарная ей новая цепь ДНК. В результате образуются два дуплекса ДНК, каждый из которых состоит из одной цепи исходной родительской молекулы ДНК и одной новосинтезированной цепи.

ДНК-полимеразы

Комплементарное копирование матрицы осуществляют ферменты ДНК-зависимые ДНК-полимеразы или просто ДНК-полимеразы. Первый фермент этого типа был открыт в 1956 г. у Е. coli, а затем ДНК-полимеразы были обнаружены в других организмах. ДНК-полимеразы ведут синтез ДНК на одноцепочечной матрице, если имеется затравка (комплементарный матрице фрагмент ДНК). ДНК-полимеразы последовательно наращивают конец затравки, шаг за шагом присоединяя к нему следующие нуклеотиды (рис. 2), причем выбор очередного нуклеотида для присоединения к концу затравки диктуется матрицей.

Очередной нуклеотид, субстрат для ДНК-полимеразы, поступает в реакцию в активированной высокоэнергетической форме дезоксирибонуклеозидтрифосфата.

Рис. 1. Матричный синтеза ДНК ДНК-полимераза шаг за шагом Рис. 2. Реакция, осуществляемая ДНК-полимеразой

удлиняет затравку. Цепи матрицы и затравки направлены в противоположные стороны — антипараллельны

В этом отношении синтез ДНК напоминает синтез всех других биополимеров: поскольку полимеризация мономеров в полимер энергетически не выгодна, мономеры всегда поступают в реакцию синтеза в активированной форме. В случае синтеза ДНК присоединение очередного нуклеотида к концу затравки сопровождается гидролизом богатой энергией связи и отщеплением пирофосфата, что и делает реакцию в целом энергетически выгодной. Наличие в клетке пирофосфатазы обеспечивает расщепление пирофосфата и делает реакцию практически необратимой. При полимеризации растет всегда 3'-конец затравки, т. е. синтез происходит в направлении 5'→3': 3'-ОН-группа концевого нуклеотида затравки атакует α-фосфат очередного дезоксирибонуклеозидтрифосфата (но только в том случае, если он комплементарен очередному нуклеотиду матрицы!), в результате чего отщепляется пирофосфат, а

дезоксирибонуклеозидмонофосфат оказывается связанным фосфодиэфирной связью с растущей цепью ДНК, удлиняя ее на одно звено (рис. 2).

Затравка антипараллельна матрице (рис. 1). Естественно, эта полярность сохраняется и при ее дальнейшем росте, так что результатом работы ДНК-полимеразы на одноцепочечной матрице является антипараллельная двойная спираль ДНК.

ДНК-полимеразы безразличны к последовательности нуклеотидов матрицы; задача этих ферментов — снять точную копию с матрицы, с какой — неважно.

Точность синтеза ДНК и коррекция

Нормальное размножение клеток требует высокой точности копирования ДНК-матрицы. Генетический материал живых организмов имеет огромные размеры. Даже у бактерий ДНК-полимераза должна практически безошибочно скопировать молекулу ДНК длиной около 3·106 п. н. Оказывается, у всех организмов точность работы peпликативной машины (включающей не только ДНК-полимеразы, но и другие белки; см. ниже) как раз такова, чтобы обеспечить безошибочное воспроизведение всего генома или допустить лишь малое число ошибок. Так, у бактерий ошибки синтеза ДНК происходят не чаще чем один раз на много миллионов нуклеотидов. Молекулярные взаимодействия, на которых основаны ферментативные реакции, в частности синтез ДНК, не могут быть абсолютно надежными, кроме того, точность процесса связана с его скоростью. Для того чтобы обеспечить высокую точность наряду с высокой скоростью репликации, природе пришлось прибегнуть к специальным механизмам, один из которых — механизм коррекции.

ДНК-полимеразы проверяют комплементарность каждого нуклеотида матрице дважды: один раз перед включением его в состав растущей цепи и второй раз перед тем, как включить следующий нуклеотид. Очередная фосфодиэфирная связь образуется лишь в том случае, если последний (3'-концевой) нуклеотид затравки комплементарен матрице. Если же на предыдущей стадии полимеризации произошла ошибка (например, из-за того, что нуклеотид в момент полимеризации находился в необычной таутомерной форме), то репликация останавливается до тех пор, пока неправильный нуклеотид не будет удален. Некоторые ДНК-полимеразы обладают не только полимеризующей, но и .3' -экзонуклеазной aкmuвностью, которая отщепляет не спаренный с матрицей нуклеотид затравки, после чего полимеризация восстанавливается. Этот механизм, коррекция, заметно увеличивает точность работы ДНК-полимераз. Мутации, нарушающие 3'-экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы, существенно повышают частоту возникновения ошибок при репликации. Напротив, мутации, приводящие к усилению экзонуклеазной активности относительно полимеризующей, снижают темп мутирования генетического материала.

Разные ДНК-полимеразы одного организма и ДНК-полимеразы различных организмов имеют разное строение. Иногда один полипептид обладает и полимеразной, и 3'-экзонуклеазной активностями, в других случаях за эти активности ответственны разные субъединицы мультисубъединичного фермента. У некоторых ДНК-полимераз корректирующая экзонуклеазная активность не обнаружена. За коррекцию в этих случаях ответствен отдельный белок.

ДНК-полимеразы бактерий

Репликация лучше всего изучена у Е. coli. У этой бактерии есть три ДНК-полимеразы (I, II и III). Все три фермента и их аналоги из других бактерий обладают корректирующей экзонуклеазной активностью.

ДНК-полимераза I состоит из одного полипептида. Эта полимераза обладает 3'- и 5'-экзонуклеазной активностями. Она удаляет различного рода дефекты из ДНК в ходе репарации и служит вспомогательной полимеразой при репликации ДНК, удаляя РНК-затравки. В клетке Е. coli имеется несколько сотен молекул ДНК-полимеразы I.

ДНК-полимераза II также состоит из одного полипептида, обладающего полимеразной и 3'-экзонуклеазной активностями. Его содержание в бактериальной клетке в несколько раз ниже, чем ДНКполимеразы I. Эта полимераза лучше всего работает на двуцепочечной ДНК с одноцепочечными брешами в несколько десятков нуклеотидов длиной. На этом основании можно предположить, что ДНК-полимераза II участвует в репарации ДНК.

Главную роль в репликации ДНК у Е. coli играет большой мультисубъединичный фермент—ДНК-полимераза III. В клетке всего несколько таких мультимеров, приблизительно столько же, сколько репликативных вилок.

ДНК-полимераза III состоит из 7 типов субъединиц (табл. 2). Полимеразной активностью in vitro обладают различные неполные агрегаты субъединиц, но репликацию проводит полная форма фермента — холофермент, содержащий все субъединицы. Полимеразная активность присуща α-субъединице, 3'-экзонуклеазная — ε-субъединице. Отличительная черта холофермента ДНК-полимеразы III — исключительно высокая процессивность синтеза ДНК (процессивностьэто количество нуклеотидов, присоединяемых ферментом к растущей цепи между двумя последовательными актами диссоциации с матрицы). В табл, 3 сравнивается процессивность разных ДНК-полимераз.

При оптимальных условиях скорость синтеза ДНК холоферментом ДНК-полимеразы III in vitro составляет около 1000 нуклеотидов в секунду, что соответствует скорости репликации in vivo.

ДНК-полимеразы эукариот

В клетках эукариотических организмов обнаружены четыре ДНК-полимеразы: α, β, γ и δ. ДНК-полимераза α считается основным ферментом ядерной репликации. Содержание этого фермента заметно возрастает во время S-фазы клеточного цикла, когда происходит активный синтез ДНК. Фермент состойт из нескольких субъединиц разного размера. Полимеразная активность присуща самой большой из субъединиц. Так же как в случае ДНК-полимеразы III E.coli, эффективность и высокая процессивность работы полимеразы а зависят до дополнительных субъединиц, которые сами по себе полимеризующей активностью не обладают. Одна из субъединиц ДНК-полимеразы α оказалась ДНК-праймазой— ферментом, необходимым для инициации новых цепей ДНК. Ассоциация с праймазой не характерна для ДНК-полимераз бактерий.

ДНК-полимераза β состоит из одного полипептида. Действие этого фермента, видимо, не процессивно. Наибольшая активность наблюдается на двуцепочечной ДНК с короткими брешами. Можно думать, что основная роль этой полимеразы состоит в репарации ДНК.

ДНК-полимераза γ состоит из нескольких идентичных субъединиц. Это митохондриальный фермент, который осуществляет синтез ДНК митохондрий. Сходный фермент обнаружен в хлоропластах растений.

ДНК-полимераза δ состоит из двух неидентичных субъединиц. Этот фермент обладает сопряженной 3'-экзонуклеазной активностью.

У низших эукариотдрожжейобнаружены две ДНК-полимеразы: I и II. По своей роли в репликации ДНК они аналогичны ДНК-полимеразам III и I Е. coli соответственно.

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ РЕПЛИКАЦИИ Инициация цепей ДНК

ДНК-полимеразы не способны инициировать новые цепи ДНК. Они могут лишь достраивать уже имеющуюся затравку. Синтез ДНК начинается с синтеза РНК-затравки. РНК-затравку для синтеза ДНК образует специальный фермент, называемый ДНК-праймазой (от англ. праймер — затравка). Праймаза может быть отдельным ферментом, как у бактерий, или входить в качестве субъединицы в ДНК-полимеразу (как у ДНК-полимеразы α животных). В любом случае праймаза — это фермент, отличный от РНК-полимераз, синтезирующих разнообразные клеточные РНК и тоже способных инициировать синтез новых полинуклеотидных цепей. Почему же в таком случае для инициации цепей ДНК используются рибонуклеотиды? Поскольку требования инициации и безошибочности синтеза противоречат друг другу, затравку, синтезированную инициирующим (а значит неточным) ферментом, необходимо как-то отличить от остальной новосинтезированной цепи. Можно думать, что именно поэтому она и состоит из рибонуклеотидов. После того, как цепь ДНК начала синтезироваться, РНК-затравки удаляются и образовавшиеся бреши застраиваются ДНК-полимеразой, т. е. с высокой точностью.

Расплетание двойной спирали ДНК в ходе репликации

Нативные ДНК двуспиральны; следовательно, перед репликацией цепи родительской молекулы, матричные цепи ДНК, должны быть разделены. Эту реакцию осуществляют два типа белков: хеликазы. и SSB-белки (от англ. single strand binding — белки, связывающиеся с однонитевой ДНК). Хеликазами называют ДНК-зависимые АТРазы, использующие энергию гидролиза АТР для расплетания двойной спирали (helix) ДНК. Считается, что хеликаза, движимая гидролизом АТР, однонаправленно «едет» по одной из цепей ДНК, расплетая перед собой двойную спираль. Есть хеликазы, которые едут от 5'-конца к 3'-концу цепи ДНК, и есть другие, перемещающиеся в обратном направлении. В результате работы хеликаз возникает «вилка» из двуспирального участка ДНК и двух одноцепочечных ветвей. Ренатурации одноцепочечных участков ДНК (образованию двуцепочечной ДНК) препятствует их связывание SSB-белком, имеющим избирательное сродство к однонитевой ДНК (рис. 30). SSB-белки и хеликазы обнаружены у многих про- и эукариотических организмов. Роль SSBбелка в репликации, по-видимому, состоит в том, чтобы расправить ДНК, вытянуть ее и удалить возможные элементы вторичной структуры, которые могли бы образоваться в самокомплементарных участках ДНК.

Прерывистый синтез ДНК.

Так как цепи ДНК в дуплексе антипараллельны, то очевидно, что направление расплетания двойной спирали при репликации совпадает с направлением синтеза ДНК лишь для одной матричной цепи, но противоположно направлению синтеза ДНК на комплементарной матрице (рис. 31). Это значит, что лишь на одной из матричных цепей синтез ДНК может происходить непрерывно. Другая цепь ДНК синтезируется сравнительно короткими фрагментами, называемыми

фрагментами Оказаки.

Таким образом, синтез ДНК на двух матричных цепях исходной молекулы заметно различается. Новосинтезированная цепь, которая синтезируется непрерывно, называется ведущей (англ. leading), другая цепь называется запаздывающей (англ. lagging). Каждый фрагмент Оказаки имеет на 5'-конце несколько рибонуклеотидов — результат действия праймазы. Характерный размер фрагментов Оказаки различается для бактерий и эукариот: у бактерий они имеют длину около 1000 нуклеотидов, у эукариот они короче, порядка 100 нуклеотидов. Через некоторое время после синтеза РНК-затравки удаляются, бреши застраиваются ДНК-полимеразой, а фрагменты сшиваются в одну ковалентнонепрерывную цепь ДНК предназначенным специально для этого ферментом, ДНК-лигазой.

двуцепочечный разрыв.

Топоизомеразы необходимы для завершения репликации не только кольцевых молекул, но и очень длинных линейных эукариотических хромосом: две очень длинные дочерние молекулы не могут разойтись достаточно быстро, поскольку после репликации оказываются запутанными.

ИНИЦИАЦИЯ РАУНДА РЕПЛИКАЦИИ

Начавшийся процесс репликации хромосомы бактерии продолжается до тех пор, пока не удвоится вся ДНК. В этом смысле бактериальная хромосома представляет собой единицу репликации — репликон. Другие молекулы ДНК, которые могут присутствовать в бактериальных клетках, также представляют собой отдельные репликоны.

Репликация каждого бактериального репликона, в частности хромосомы Е. coli, как правило, начинается в одной избранной области ДНК, называемой ориджином репликации (от англ. origin — начало, обозначается ori). Ориджин репликации каждого репликона имеет вполне определенную последовательность ДНК В результате инициации раунда репликации на ориджине образуются одна или две репликативные вилки.

Если возникает одна репликативная вилка, как, например, у плазмиды ColE1, то, объехав всю кольцевую молекулу, она заканчивает синтез на ориджине. Такая репликация называется однонаправленной. На многих ориджинах, в частности на хромосомном ориджине Е. coli, инициируется двунаправленная репликация, т. е. возникают две репликативные вилки, перемещающиеся в противоположных направлениях до тех пор, пока не встретятся. Реплицирующиеся кольцевые репликоны имеют характерную структуру, напоминающую греческую букву тэта (θ) и называемую тэта-структурой

Последовательность ориджина способствует необходимому для начала синтеза ДНК расплетанию двойной спирали ДНК и служит участком сборки, «посадки» на ДНК активного комплекса белков осуществляющих репликацию.

Регуляция репликации

При каждом клеточном делении каждая молекула ДНК должна удваиваться, т. е. на каждом ориджине дрлжен происходить в точности один акт инициации репликации. В противном случае постепенно происходила бы утеря репликона или его бесконтрольное накопление. Более того, даже если репликон удваивается в среднем точно один раз на каждое клеточное деление, возможны существенные вариации количества копий этого репликона вокруг среднего значения в разных клетках бактериальной популяции. Такие вариации недопустимы, так как в конце концов ведут к потере репликона. Таким образом, к регуляции репликации предъявляются достаточно жесткие требования: регуляторная система должна чувствовать отклонения в обе стороны от среднего числа копий данного репликона и соответствующим образом менять частоту инициации на ориджине. Очевидно, что частота инициации должна быть согласована также со скоростью роста клеток.

СЕГРЕГАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РЕПЛИКОНОВ ПО ДОЧЕРНИМ КЛЕТКАМ ПРИ ДЕЛЕНИИ Стабильное поддержание любого репликона требует не только согласования его репликации с клеточным делением, но

и упорядоченного распределения молекул ДНК по дочерним клеткам. Считается, что правильная сегрегация достигается у бактерий за счет прикрепления ДНК к мембране, причем пространственная организация участков прикрепления и зоны роста мембраны и клеточной стенки обеспечивает автоматическое «растаскивание» двух копии прореплицировавшейся молекулы ДНК по разным дочерним клеткам (рис. 40). Подобная стратегия, видимо, характерна не только хромосомам, но и низкокопийным плазмидам.

Многие мелкие репликоны (мелкие плазмиды) используют альтернативную стратегию стабильного наследования. Они, по-видимому, не имеют механизма упорядоченной сегрегации, но поддерживаются в высоком числе копий. Высокая копийность обеспечивает относительно стабильное наследование репликона при случайном распределении молекул по дочерним клеткам при делении. Вероятность того, что репликон при таком способе распределения будет утерян (т. е. в одну из дочерних клеток не попадет ни одной копии ДНК данного репликона), равна (1/2)n, где п — число копий, т. е. меньше 0,1% уже для 10 копий плазмиды в клетке. Естественно, для этого способа принципиально важным является строгое восстановление копийности, чтобы единственная молекула ДНК успела быстро размножиться до характерного для нее числа копий до начала следующего деления клетки.

Рис. 39. Структура реплицирующейся

бактериальной хромосомы

Рис. 40. Механизм упорядоченной сегрегации

ОСОБЕННОСТИ РЕПЛИКАЦИИ ДНК ЭУКАРИОТ

Эукариотические геномы, как правило, значительно больше бактериальных, а скорость синтеза ДНК у эукариот, напротив, существенно ниже (несколько десятков нуклеотидов в секунду). Видимо, по этой причине инициация синтеза ДНК эукариот происходит во многих разных точках хромосомы, т. е. эукариотические хромосомы имеют полирепликонную организацию. Характерный размер репликона высших эукариот — около 100 000 п. о. По крайней мере у низших эукариот, например у дрожжей, инициация происходит не на случайных последовательностях, а на вполне определенных ориджинах репликации.

Инициация репликации строго регулируется. Полирепликонная организация требует, чтобы в каждом цикле клеточного деления каждый ориджин «сработал» только один раз, в противном случае на хромосоме образуются разветвленные структуры.

Репликация концов эукариотических хромосом

Неспособность ДНК-полимераз инициировать новые цепи и то, что они умеют удлинять только 3'-конец, делают невозможной полную репликацию линейной ДНК. В каждом раунде репликации линейные молекулы должны укорачиваться.

Теломерные области были выделены из ДНК ряда низших эукариот — инфузорий и дрожжей. Оказалось, что на концах хромосом этих организмов имеются простые повторяющиеся последовательности, например у тетрахимены теломерная последовательность такова: (TTGGGG)n. Эта повторенная последовательность «загнута» сама на себя за счет неканонических G-G-пар оснований и образует несовершенную шпильку, так что свободных 5'- и 3'-концов у хромосомы нет. Имеющийся в ядре фермент безматрично присоединяет к 3'-концу хромосомной ДНК последовательность концевого повтора, причем фермент работает лишь в том случае, если на конце ДНК теломерные повторы уже присутствуют (рис. 42).

Сегрегация эукариотических хромосом при делении клеток

Известно, что в мейозе и в митозе хромосомы упорядоченно расходятся по дочерним клеткам с помощью аппарата веретена, микротрубочки которого обеспечивают «растягивание» дочерних хромосом или гомологов к разным полюсам. Микротрубочки веретена прикрепляются к специальному участку хромосомы — кинетохору. Это белковый комплекс, который собирается на специализированной последовательности хромосомной ДНК—центромере.

Поскольку с помощью методов клонирования у дрожжей были выделены все элементы, необходимые для репликации и наследования хромосом — ориджины репликации, теломеры и центромеры,— то оказалось возможным создать искусственную хромосому, состоящую из соединенных вместе двух теломер, центромеры, ориджина репликации и ДНК «наполнителя», роль которой может играть ДНК с любой последовательностью, например ДНК фага лямбда. Оказалось, что искусственная хромосома поддерживается в дрожжах, причем стабильность ее наследования не намного ниже, чем стабильность собственных дрожжевых хромосом.

Рис. 42. Модель репликации теломер (на примере Рис. 41. Схема, демонстрирующая сложности, тетрахимены)

возникающие при репликации линейных молекул ДНК (Репликацня запаздывающей цепи не может пройти полностью, так как даже если РНК-затравка и может образоваться на самом конце матричной цепи. то после ее удаления ни одна ДНКполимераза не сможет восстановить незастроенный участок)

Занятие 3. Тема: Репарация ДНК

Видимо, уже на ранних стадиях эволюции ДНК заменила РНК в качестве носителя генетической информации. Этому гипотетическому событию должны были способствовать большая химическая устойчивость ДНК, связанная с заменой рибозы на дезоксирибозу, и двуцепочечное строение, «скрывающее» целый ряд реакционноспособных группировок. Но несмотря на свои «преимущества», ДНК постоянно подвергается химическим изменениям, как спонтанным, так и индуцируемым мутагенами и даже клеточными метаболитами. Еще одна обычная причина повреждений ДНК—радиация и ультрафиолетовое облучение. Большинство происходящих с ДНК изменений недопустимы: они либо приводят к вредным мутациям, либо блокируют репликацию ДНК и вызывают гибель клеток. Поэтому все клетки имеют специальные системы исправления повреждений, репарации ДНК. Нарушение этих систем губительно. Репарация ультрафиолетовых повреждений ДНК нарушена у людей, страдающих тяжелым наследственным заболеванием — пигментной ксеродермой. Такие больные не могут бывать на солнце и обычно умирают в раннем возрасте от какого-либо злокачественного заболевания.

Принципы репарации ДНК У различных организмов сходны, поэтому рассмотрим эти принципы на примере Е. coli, где они сравнительно хорошо изучены.

НАРУШЕНИЯ, ВОЗНИКАЮЩИЕ В ДНК В ДНК сравнительно часто и спонтанно происходят апуринизация и дезаминирование оснований. Масштабы

апуринизации можно оценить по тому, что ДНК каждой клетки человеческого организма ежедневно теряет около 5000 пуринов. Результатом апуринизации является АР-сайт (англ. apurinic-apyrimidinic)—дезоксирибоза, лишенная основания.

При дезаминировании цитозин превращается в урацил, аденин — в гипоксантин, а гуанин — в ксантин. Наиболее вредно дезаминирование цитозина и аденина: обе реакции после репликации приводят к мутациям. Чаще всего дезаминируется цитозин; в ДНК каждой человеческой клетки за день происходит около 100 таких событий. При дезаминировании всех оснований возникают основания, не характерные для ДНК. Это обстоятельство позволяет репаративной системе клетки узнавать продукт дезаминирования и удалять его. Можно утверждать, что именно поэтому в ДНК в отличие от РНК вместо урацила присутствует тимин: урацил неотличим от продукта спонтанного дезаминирования цитозина.

Рис. 43. Некоторые типы повреждений ДНК (Показаны сравнительно часто возникающие повреждения. Апуринизация и дезаминирование происходят спонтанно. Алкилирование оснований — результат действия многих мутагенов.

Пиримидиновые димеры образуются под действием ультрафиолетового облучения)

Многие канцерогены алкилируют, например метилируют, основания ДНК. Наиболее частые продукты этих реакций — это О6-метилгуанин, 7-метилгуанин и 3-метиладенин. Первое из этих изменений мутагенно, а два других делают еще более лабильной N-гликозидную связь между основанием и сахаром, т. е. способствуют апуринизации.

Иногда может происходить размыкание пуринового кольца. Продукт формамидопиримидин представляет затруднение для репликации.

Главным нарушением, возникающим под действием ультрафиолета, является насыщение двойных связей оснований и образование пиримидиновых димеров из двух соседних пиримидинов цепи ДНК.

ПРЯМАЯ РЕАКТИВАЦИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК Ряд повреждений клетка удаляет из ДНК путем прямой реактивации. Так, по крайней мере у бактерий существует

специальный фермент, метилтрансфераза, который переносит метильную или этильную группу с алкилированного основания на один из собственных цистеиновых остатков. Алкилированный в результате собственной активности белок инактивируется, но может служить регулятором активности своего гена и нескольких других.

У многих организмов обнаружен фотореактивирующий фермент (PRE, англ. photoreactivating enzyme), или фотолиаза, репарирующии пиримидиновые димеры.

Другие виды репарации ультрафиолетовых повреждений ДНК называют темновой репарацией, чтобы отличить от прямой фотореактивации.

ЭКСЦИЗИОННАЯ РЕПАРАЦИЯ Если невозможна прямая реактивация, работают механизмы эксцизионной репарации, удаляющие из ДНК нарушенные

участки. Так, практически на каждое аномальное основание, которое может возникнуть в ДНК, существует своя ДНК-N- гликозилаза— фермент, с высокой специфичностью узнающий в ДНК определенное аномальное основание, например формамидопиримидин, и вырезающий его с разрывом N-гликозидной связи (рис. 44). У Е. coli есть около 20 различных ДНК-N-гликозилаз.

После действия ДНК-N-гликозилазы в ДНК остается АР-сайт. Репарация такого повреждения может идти одним из двух путей. У эукариот был обнаружен фермент ДНК-инсертаза, способный непосредственно пришивать к дезоксирибозе основание в соответствии с комплементарной цепью ДНК. Пока обнаружены лишь пуриновые инсертазы, видимо вследствие того, что апуринизация происходит значительно чаще, чем потеря пиримидинов. Второй путь репарации открывают ферменты, обнаруженные у всех организмов,— АР-эндонуклеазы. АР-эндонуклеазы разрывают сахарофосфатный остов ДНК в АР-сайте. Разорванная после действия АР-эндонуклеазы цепь ДНК подвергается действию экзонуклеазы, удаляющей поврежденный участок. По крайней мере в некоторых случаях эту реакцию, видимо, осуществляет 5'-

Степень индукции SOS-системы определяется количеством повреждений в ДНК: при небольшом количестве повреждений возрастает уровень некоторых репаративных белков, работавших и до индукции, например UvrA, В, С и D. При большем количестве повреждений блокируется деление клеток (в норме оно восстанавливается, если клетке удалось «починить» ДНК) и индуцируется синтез белка-продукта гена recA, необходимого для рекомбинационной, репарации и для дальнейшей индукции SOS-системы. При еще большем количестве повреждений ДНК индуцируются гены umuC и umuD, которые ответственны за особый путь репарации, сопряженный с возникновением мутаций. Механизм действия продуктов генов umuCD не ясен, но предполагается, что они позволяют ДНК-полимеразе копировать нарушенный участок матрицы (рис.47). Для этого продукты генов umuCD и rесА должны изменить свойства ДНК-полимераз. Оказалось, что корректирующая активность ε-субъединицы ДНК-полимеразы III специфически подавляется RecA-белком, связанным с поврежденным участком матрицы, например тиминовым димером.

Таблица 5. Некоторые гены SOS-системы и результат их индукции

Рис. 48. Схематический график, иллюстрирующий тонкую настройку SOS-системы

(Степень индукции разных генов, входящих в SOSсистему, по-разному зависит от количества повреждений ДНК)

Можно думать, что продукты генов umuCD позволяют ДНК-полимеразе «в виде исключения» удлинять затравку, последний нуклеотид которой не спарен с матрицей. Подобное совместное действие продуктов генов umuCD и RecA-белка может быть полезным для выживания в условиях, когда повреждений в ДНК очень много, в то же время очевидно, что активность генов umuCD приводит к появлению мутаций, поскольку при репликации напротив поврежденного участка матрицы, по-видимому, вставляется произвольный нуклеотид. В любом случае гены umuD и umuС обеспечивают весь мутагенный эффект ультрафиолетового облучения и многих химических мутагенов.

Таким образом, мутагенез не является пассивным процессом, а требует активного вмешательства продуктов определенных клеточных генов. Эти генные продукты «обрабатывают» первичное нарушение в ДНК и лишь после этого возникает мутация.

Степень индукции SOS-системы в определенном смысле отражают «благополучие» клетки и ее шансы на выживание. Поэтому некоторые относительно автономные внутриклеточные генетические элементы, например умеренные бактериофаги, используют индукцию SOS-системы в качестве сигнала для размножения и уничтожения клетки-хозяина: безвредный до того участок хромосомы (профаг), «почувствовав» слабость хозяина, начинает размножаться и уничтожает его, чтобы спастись самому.

SOS-система — это не единственная индуцируемая система репарации у Е. coli. Совершенно другой набор генов индуцируется в ответ на алкилирующие соединения.

РЕПАРАЦИЯ НЕСПАРЕННЫХ НУКЛЕОТИДОВ Системы репликации и репарации ДНК хоть и очень редко, но все же ошибаются. В результате в ДНК может включиться

«неправильный», т. е. не комплементарный матрице, нуклеотид. Другой источник неспаренных нуклеотидов — гомологичная рекомбинация, в ходе которой образуются гетеродуплексы, состоящие из двух комплементарных цепей, исходно принадлежавших разным молекулам ДНК. Такие нарушения структуры ДНК репарируются, по крайней мере у бактерий и низших эукариот. Система репарации должна каким-то образом отличать друг от друга две цепи одной молекулы ДНК, чтобы решить, какой из двух неспаренных нуклеотидов «правильный», и заменить «неправильный» нуклеотид на нуклеотид, комплементарный «правильному».

В случае нарушений спаривания, возникающих в результате репликации или репарации, новосинтезированная цепь ДНК некоторое время может отличаться от матричной цепи наличием одноцепочечных разрывов или брешей. Не исключено, что это различие использует система репарации, контролирующая правильность спаривания оснований.

Другое отличие между новосинтезированной и матричной цепями, по крайней мере у Е. coli, обусловлено метилированием ДНК. Метилаза, кодируемая геном dam, метилирует аденины в последовательности GATC. Большинство таких последовательностей метилированы в обеих цепях ДНК. После репликации возникает полуметилированная ДНК: последовательности GATC метилированы только в матричной, но не в новой цепи (рис. 49). Со временем полуметилированные участки метилируются полностью, но пока отличие существует, оно служит указанием о направлении репарации неспаренных нуклеотидов для специализированной репарационной системы.

метилированная ДНК; II — полуметилированная ДНК; III — полностью метилированная ДНК

МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК И «ГОРЯЧИЕ ТОЧКИ МУТАГЕНЕЗА» Метилирование не только способствует репарации ДНК, но может напротив, облегчать мутагенез. В природе широко

распространено метилирование цитозина. Каждый метилированный цитозин потенциально мутагенен, поскольку продуктом его спонтанного дезаминирования является тимин, нормальное для ДНК основание, а не урацил (продукт дезаминирования цитозина), который удаляется урацил-ДНК-гликозилазой. У Е. coli за счет активности гена dcm цитозины метилированы в последовательности CCA/TGG. Показано, что метилированный (внутренний) цитозин в этой последовательности действительно является «горячей точкой мутагенеза».

Дублирование информации в двух комплементарных цепях ДНК не позволяет безошибочно исправлять все типы повреждений. Описанные механизмы репарации не могут справиться с такими нарушениями структуры ДНК, как ковалентные межнитевые сшивки, которые могут возникать под действием ряда мутагенов, или двуцепочечные разрывы ДНК, вызываемые, например, γ-облучением. Такие повреждения могут репарироваться только при наличии гомологичной неповрежденной молекулы ДНК, т. е. рекомбинационным путем.

Занятие 4. Тема: Рекомбинация, рестрикция и модификация ДНК.

Рекомбинацией в общем смысле слова можно назвать возникновение новых последовательностей ДНК за счет разрывов и перевоссоединений предсуществующих молекул. Это понятие объединяет обширный круг разнообразных биологических явлений, роль которых будет рассмотрена по мере их описания.

ГОМОЛОГИЧНАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

Общая, или гомологичная, рекомбинация характерна для всех живых организмов от вирусов и бактерий до многоклеточных эукариот. При гомологичной рекомбинации происходит обмен участками между гомологичными, т. е. очень похожими по последовательности, молекулами ДНК. Так, к общей рекомбинации относятся обмены между гомологичными хромосомами в мейозе у эукариот и рекомбинационная инициация репликации ДНК бактериофага Т4. В первом приближении можно сказать, что гомологичная рекомбинация не создает принципиально новых последовательностей, а перетасовывает уже имевшиеся сходные варианты одной и той же последовательности (рис. 51). Чтобы подчеркнуть важность этого свойства, достаточно сказать, что при гомологичной рекомбинации между двумя сходными генами, кодирующими белок, оба рекомбинантных продукта оказываются не нарушенными, не происходит, например, сдвига рамки считывания. Другими словами, при гомологичной рекомбинации каким-то образом обеспечивается взаимное узнавание одинаковых (или очень сходных по последовательности) участков рекомбинирующих молекул. Если же гомологии нет, то и рекомбинация такого рода происходить не будет.