Лр №9

	Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный аграрный университет»	Методические указания
		С2.Б.11 Ветеринарная микробиология и микология

Кафедра инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы

С2.Б.11 ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И МИКОЛОГИЯ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным работам

Направление подготовки

111801 Ветеринария

Профиль подготовки

специализация Ветеринарная фармация

Квалификация выпускника

специалист

Уфа 2013

УДК637.12.04/.07:378.147

ББК 36.95+74.58

А 65

Рекомендовано к изданию методической комиссией факультета биотехнологий и ветеринарной медицины (протокол № 2 от « 04 » сентября 2013 г.)

Составитель: профессор, д-р биол. наук А. В. Андреева

доцент, канд. биол. наук З. З. Ильясова

Рецензент: зав. кафедрой морфологии, патологии, фармации

и незаразных болезней, д-р ветеринар. наук Гимранов В.В.

Ответственный за выпуск:

зав. кафедрой инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы, д-р биол. наук, профессор Андреева А.В.

г. Уфа, БГАУ, кафедра инфекционных болезней,

зоогигиены и ветсанэкспертизы

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 9

Биохимические свойства микроорганизмов

Цель занятия. Изучить биохимическую дифференциацию микроорганизмов. Установить различие между эшерихиями и сальмонеллами на средах с углеводами и многоатомными спиртами (цветной ряд, среда Эндо). Провести химическое и микроскопическое исследования культуры и изучить основных представителей процесса аммонификации.

Оборудование и материалы: культуры аммонифицирующих микроорганизмов на МПБ, МПА и МПЖ (Bac. Mycoides, Bac. Mesentericus, Bac. Subtilis, фуксин Пфейффера, предметные и покровные стекла, микроскопы, горелки, спички, посевы культур E. Colli, S. dublin на МПБ и МПА, а также на средах с углеводами и многоатомными спиртами (лактоза, сахароза, глюкоза, маннит, дульцит и др.), посев этих культур на среде Эндо в чашках Петри, кедровое масло. Таблицы: биохимическая дифференциация энтеробактерий – микробов кишечно-сальмонеллезной группы, аммонифицирующие микроорганизмы.

Жизненные процессы микроорганизмов тесно связаны с деятельностью ферментов. Каждому виду микробов свойственны определенные ферменты, что позволяет дифференцировать их с учетом других признаков и свойств.

К биохимической дифференциации прибегают обычно в том случае, если микроорганизмы имеют много общих признаков: трудно различимый рост на питательных средах, клетки, морфологически похожие друг на друга, и т. д. Такое сходство наблюдается среди эшерихий и сальмонелл. При их дифференциации кроме сбраживания сахаров учитывают способность свертывать молоко, образовывать газы и другие свойства. В молоке содержится лактоза, которую сбраживает кишечная палочка. В результате образуется кислота, обуславливающая свертывание продукта. При высеве на молоко возбудителя сальмонеллеза кислота не продуцируется.

Биохимические свойства – способность микроорганизмов под действием своих ферментов расщеплять органические соединения.

Различают сахаролитические, протеолитические и гемолитические свойства.

Сахаролитические свойства микроорганизмов - способность микроорганизмов под действием своих ферментов расщеплять сахара (углеводы).

Ферменты, образуемые микробами, обладают способностью расщеплять сахар (углеводы и многоатомные спирты) на альдегиды и кислоты. Конечные продукты ферментации – диоксид углерода (СО₂) и водород. Разные ферменты неодинаково реагируют с одними и теми же сахарами. Это их свойство используется при биохимической дифференциации микроорганизмов.

Сахаролитические свойства микробов изучают в жидких, плотных и полужидких питательных средах.

Сахаролитические свойства в жидких питательных средах. Выявляют на средах Гисса (среды с сахарами), которые представляют собой смесь сахара и индикатора в пептонной воде. Из сахаров используют лактозу, глюкозу, маннит, мальтозу, сахарозу, арабинозу, дульцит и др. В качестве индикаторов применяют нейтральный красный лакмус, фуксин основной и т. д. Среды могут быть жидкими, тогда для улавливания газа на дно пробирки опускают маленькие пробирки Уленгута «газовки» перевернутые (направленные) закрытым концом вверх. Образовавшийся в процессе ферментации газ вытесняет часть среды и скапливается в верхней части «газовки».

Сахаролитические свойства в полужидких питательных средах с углеводами и индикатором ВР (смесь водного голубого и розоловой кислоты) могут наблюдаться разрыв столбика агара и скопление мелких пузырьков в толще среды и на ее поверхности, а также изменение цвета. При нейтральной реакции индикатор не изменяется (бесцветный), в кислой среде он принимает синий цвет, в щелочной – красный. В такой же цвет окрашивается и агар. Чистые культуры высевают на такие среды и выдерживают в термостате при определенной температуре (для патогенных – 37⁰С, для сапрофитов – 25-30⁰С).

Сахаролитические свойства на плотных питательных средах. Биохимическую дифференциацию осуществляют и на среде Эндо. Агар Эндо содержит углевод лактозу и индикатор обесцвеченный фуксин, который в щелочной среде бесцветный, а в кислой среде восстанавливает свой цвет (краснеет).

При сбраживании микробами лактозы образуется кислота, восстанавливается фуксин, который окрашивает колонии в красный цвет. Кишечная палочка (эшерихий) расщепляет лактозу и среда окисляется. В кислой среде восстанавливается фуксин и колонии кишечной палочки на среде Эндо окрашиваются в кирпично-красный цвет с металлическим оттенком. Цвет колоний сальмонеллезных бактерий не изменяется, так как они не сбраживают лактозу.

Протеолитические свойства микробов – способность микроорганизмов под действием своих ферментов расщеплять белки (протеин). Белки расщепляются микроорганизмами с образованием газообразных продуктов: аммиака, сероводорода и индола.

Определение аммиака. Аммиак (продукт гнилостного распада белков) выявляют по изменению розовой лакмусовой бумаги, которая в присутствии этого вещества синеет. В пробирку с посевом, между стенкой и пробкой пробирки, закрепляют над культурой розовую лакмусовую бумагу, которая при наличии аммиака вступает во взаимодействие с её парами и образуется щелочь, лакмусовая бумага синеет. По посинению лакмусовой бумаги судят о наличии аммиака.

Аммиак в среде можно также установить при помощи реактива Несслера. Для этого в фарфоровую чашку пипеткой вносят каплю культуры аммонификаторов, выращенной на мясопептонном бульоне, и такое же количество реактива Несслера. При наличии аммиака смесь окрашивается в желтый или коричневый цвет (в зависимости от количества). Коричневое окрашивание указывает на большое содержание продукта гнилостного распада.

Определение сероводорода. Сероводород (конечный продукт серосодержащих аминокислот – цистина, цистеина, метионина) можно обнаружить с помощью полоски фильтровальной бумаги размером 1 см х 15 см, обработанной 5%-ным водным раствором уксуснокислого свинца и подвешенной над культурой исследуемых микробов. При содержании сероводорода бумага чернеет, который превращает уксуснокислый свинец в сернокислый. Сероводород на белковых средах образует аммонификаторы и другие организмы. По почернению фильтровальной бумаги судят о наличии сероводорода.

Определение индола. Индол (продукт превращения аминокислоты триптофана) выявляют на среде без углеводов, особенно глюкозы, которая препятствует его образованию. Индолообразование – один из признаков при определении вида микробов, поэтому его используют при их дифференциации. Существует несколько методов определения индола (Эрлиха, Сальковского, Строгова и др.), но наиболее простой и доступный из них – метод Морелли: определение проводят с помощью полоски фильтровальной бумаги, смоченной горячим насыщенным 12%-ным водным раствором щавелевой кислоты и высушенной в термостате. Бумагу подвешивают так же, как и при определении продуктов аммонификации. Культуру выращивают трое суток в термостате, затем определяют результаты взаимодействия продуктов жизнедеятельности микробов и щавелевой кислоты. Порозовение нижней части индикаторной бумаги указывает на наличие индола.

Определение каталазы. Фермент каталаза разлагает пероксид водорода на кислород и воду. Для ее определения на предметное стекло наносят каплю 2-3% раствора пероксида водорода и такое же количество микробной культуры. При наличии у данного вида микробов каталазы выделяются пузырьки газа (кислород).

Гемолитические свойства микробов – способность микроорганизмов под действием своих ферментов расщеплять гемоглобин.

Некоторые виды бактерий в процессе жизнедеятельности вырабатывают особые вещества, обладающие лизирующим (растворяющим) действием на эритроциты. Эти вещества белковой природы называются гемотоксинами. Для определения гемолитической способности производят посев на питательные среды, содержащие 5% дефибринированной крови (чаще используют кровяной МПА). При росте на кровяной среде микроорганизмов, обладающих гемолитическими свойствами, вокруг колоний в результате лизиса эритроцитов образуется прозрачная зона (бесцветная или окрашенная). В жидких питательных средах при гемолизе среда становится прозрачной (красно-лаковая кровь).

Задания

1 Ознакомиться с тестами, характеризующими ферментативные свойства бактерий (ферментация углеводов в средах Гисса, образование индола, сероводорода; тесты на каталазу).

2 Используя карточки с описанием свойств бактериальной культуры, при помощи определителя микробов установить её видовую припринадлежность.

Вопросы для самоконтроля знаний

1 Методы определения сахаролитических свойств микроорганизмов.

2 Методы определения протеолитических свойств микроорганизмов.

3 Методы определения индола, сероводорода, аммиака.

4 Определение гемолитических свойств микроорганизмов.

Библиографический список

1. Асонов, Н. Р. Микробиология [Текст] : учеб. для студ. Вузов по спец. 310700 «Зоотехния» / Н. Р. Асонов. – 4-е изд., перераб. И доп. – М.: Колос, 2001.

2. Ветеринарная микробиология и иммунология [Текст] : учеб. для студ. вузов по спец. «Ветеринария» / Н. А. Радчук, Г. В. Дунаев, Н. М. Колычев [и др.] ; под ред. Н. А. Радчука. – М. : Агропромиздат, 1991.

3. Кисленко, В. Н. Ветеринарная микробиология и иммунология [Текст]: учебник для студ. Вузов, обуч. По спец. 111201 «Ветеринария» / В. Н. Кисленко, Н. М. Колычев. – М. : КолосС, 2006 – 2007.Ч .1Общая микробиология

4. Кисленко, В. Н. Ветеринарная микробиология и иммунология [Текст]: учебник для студ. Вузов, обуч. По спец. 111201 «Ветеринария» / В. Н. Кисленко, Н. М. Колычев ; Международная ассоциация «Агрообразование». – М. : КолосС, 2006 – 2007.Ч.3 Частная микробиология

5. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст] : учеб. для студ. вузов по спец. «Ветеринария» / Р.Г.Госманов, Н.М. Колычев, А.А. Барсков. – Омск: Изд-во ОМГАУ, 2008. – 309 с.

6. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст] : учеб. для студ. вузов по спец. «Ветеринария» / В.Н. /В.Н.Кисленко. – М.: КолосС, 2005. – 230 с.

7. Руководство по микробиологии и иммунологии [Текст]: учеб. пособие для студ. Вузов, обучающихся по спец. «Ветеринария», «Ветеринарно-санитарная экспертиза» : допущено МСХ / [Н. М. Колычев и др.] ; под. Общ. Ред. Н. М. Колычева, В. Н. Кисленко. - Новосибирск: Арта, 2010. - 254 с