Оу уралы (жалпы микробиология) каз

Тапсырма 2. Бөліп алған микробқа идентификациясын жасау үшін шыныда агглютинация реакциясын кою тәжірибиесі.

Ескерту: Иммундық сары су тамшысы бар бактериялық ілмекті физ.ертіндісіне қосуға болмайды. Микробтардың жабысуы тәжірибенің бірінші минутынан бастап көрінеді, шыныны сәл айналдырғанда қоспада түйіршіктер пайда бола бастайды, үлкейіп тамшының шетіне шығады. Бақылау қоспасында біркелкі гомогенді лайлану байқалады. Тәжірибенің қорытындысының суретін альбомға салу керек.

Тікелей емес (пассивті) гемагглютинадия реакциясы (ТЕГР)

Бұл реакция — агглютинация реакциясының бір түрі, негізгі принципі - эритроциттер өз беткейіне ертінді антигендер және гаптендерді жабыстыра (адсорбция) алатын қабілеті (бактерияларды, вирустарды және т.б. микроорганизмдерді). Осы жағдайда эритроциттер жаңа серологиялық арнайы қабілетке ие болады, сондықтан иммундық сары сулармен, гомологиялық адсорбцияланған антигендермен агглютинация реакциясына қатысады. Осындай эритроциттерді сенсибилизацияланған эритроциттер, эритроцитарлық диагаостикум деп атайды. Сенсибилизацияланған эритроциттерді алу үшін эритроциттерді алдын-ала танинмен 1:20000 ертіндіде өңдейді, бұл жағдайда олардың адсорбцияланатын қабілеті (жабысу) жоғарлайды. Реакцияны полистеролдық плашнетаға немесе пробиркада жасайды. Тексерілетін қан сары суындағы комплементтен ажырату үшін алдын ала 58°С 30 мин қыздырады. Сосын сары судан ертінді қатарын дайындайды 1:10-нан 1:12000-ге дейін және одан жоғары, 0.5 мл пробиркаларға немесе планшета лункаларына құяды. Әр сары су ертіндісіне 0.1 мл эритроцитарлық диагностикум қосады. Реакцияны бөлме температурасында 2 сағат ұстайды немесе термостатта. Қорытындысы оң + - егер пробирка немесе лунка түбіндегі эритроциттер тұнбасының шеттері

91

иректелген - қол шатыр теріздес. Реакцияның қорытындысы теріс - жағдайда эритроциттер тұнбасы біркелкі түбіне түседі, түйме тәріздес.

Тапсырма 3. ТЕГР (РПГА) қою төжірибесі (ауру адамның микробқа қарсы антидснелерін табу үшін). Серодиагностика.

ТЕГР-ны қою схемасы (Видаль реакциясы - іш сүзектің диагностикасы)

Ескерту: бірінші пробиркадан 1,0 мл екіншіге апару, 2-ші пробиркадан 3-ге, 3-ші пробиркадан - 4-ге, 5-ден 1,0 мл дез.ертіндісіне құйып тастау. Диагностикумның 0,1 мл-ден әрбір пробиркаға енгізу, 2 сағатқа термостатқа қою немесе бөлмеде сақтау. Қорытындысын 2 сағаттан кейін жүргізеді.

ТЕГР-ны есептеу, альбомға сурет салу, зерттеген сары судың титрін анықтау.

Коагглютинация реакциясы.

Бұл реакция - агглютинация реакциясының бір түрі: стафилококктың А—белогы иммуноглобулиндердің IgG тобы молекуланың Ғс-фрагментімен спецификалық емес байланысуға қабілетті. Коагглютинация реакциясын қою үшін стафилококктың Cowan—1 штаммын қолданылады (осыдан әдістің атауы - Co—(Ко-)-агглютинация.

Коагглютинация реакциясьгн екі вариантта қолданылады:

1. Әр түрлі биологиялық сұйықтықтарда патогенді микроорганизмдердің антигендерін табу үшін (несепте т.б.) Бүл үшін антиденелік Ко— диагностикум дайындайды: - стафилококк жасушаларының үстінде белгілі спецификалық IgG-ді адсорбциялайды (жабыстырады). Зерттейтін құралда антиген (Аг) бар болса еңгізген Ко— диагностикумымен тез арада агглютинация болады.

92

б) антигені бар зерттеу құралға қосу.

Осындай вариант көкжөтел, менингококтық инфекциялардың және т. б. тез арада анықтауын қою үшін қолданылады.

2. Созылмалы бактериялық инфекцияларды анықтау үшін.

Созылмалы инфекциялардың қоздырғыштары өз беткейінде спецификалық антиденелерді тасымалдайды, сондықтан олар стафилококк Cowan-1 штаммымен агглютинация реакциясын беруі мүмкіндігі бар. Мысалы, пиелонефрит ауруында әр түрлі шартты-патогенді бактериялар бөлінеді (E.coli, P.aeruginosa, эпидермальды стафилоккк және т.б.).

Шығарып алынған дақыл Cowan-1 штаммымен агглютинация берсе, бұл созылмалы инфекция деп есептелінеді.

Кумбс реакциясы (антиглобулинді реакция)

Бұл реакцияны құрамында 1 ғана белсенді орталығы бар және антигеннің бір детерминантты тобымен байланысатын толық емес (моновалентті, тежеуші) антиденені анықтау үшін қолданады. Сондықтан да пайда болған антиген-антидене комплексі микроагрегат, тұнба түзбейді, лайланбайды және басқа да өзгерістерге ұшырамайды. Ал Кумбс реакциясы нәтижені көзбен қарап-ақ бағалауға мүмкіндік береді. Диагностика үшін: резус-келіспеушілікте, бруцеллезде, аутоиммунды ауруларда (қызыл бөрі ауруы, полиартрит) қолданады.

Мақсаты: Жүкті әйелдің зерттелетін сары су құрамында, резус-антигенге қарсы толық емес антиденені анықтау үшін. Ингредиенттері: зерттелетін сары су, қоянның антиглобулинді сарысуы (АГС), құрамында резус-антигені бар эритроцит. АГС-ті қоянды адамның глобулиндерімен иммунизациялау жолы арқылы дайындайды. АГС-тің құрамында адамның әртурлі глобулиндеріне қарсы толық, бивалентті антиденелер бар.

Техникасы және нәтижесі:

93

Зерттелетін сарысуға резус-антигені бар эритроцит қосылады. 1 сағат инкубациядан кейін АГС-ті енгізеді. Реакция нәтижелі болса, гемагглютинация байқалады.

Преципитация реакциясы

Преципитация реакциясы электролит қатысуында спецификалық антиденелермен (преципитиндермен) ұсақ бытыраулы (мелкодисперсные) антигендердің (преципитогендердің) тұндыру. Ертілмейтін антиген + анти-дене тұнба жөнінде комплекстің тұндырылуы тек қана ингредиенттердің баламалы ара қатысында байқалады. Преципитиноген мөлдір коллоидты ертінді болу керек. Преципитация реакциясы антиденелер ұстайтын белгілі преципитациялайтын сары су бойынша антигендерді анықтау үшін қолданылады; сары суды жануарларды белгілі антигенмен иммунизация жасап алады.

а) Кольцепреципитация реакциясын қою үшін пробиркаларға (диаметрі 0.5 см) 0,1 мл диагностикалық сары суын әр түрлі антигендерге қарсы құяды, сосын оның үстіне Пастер пипеткасымен пробирканың қабырғасымен зерттейтін құралды қабаттайды. Реакцияны 1-2 минуттан кейін есептейді. Реакцияның қорытындысы оң болса - сары судың және зерттейтін құралдың арасында ақ сақина сияқты преципитат пайда болады. Бақылау (контроль) пробиркада болмау керек.

б) Гельдегі преципитация реакциясы: антиген және антидене гельде байланысып, преципитат пайдалынады. Преципитат гельде ақ түсті сызық болып келеді.

Қою техникасыны бойынша преципитация реакциясының екі түрін ажыратады:

1.Қарапайым диффузия әдісі: иммундық сары су қосылған бір қабатты агарды гель дайындайды және осы қабатта істелінген шұңқырға антиген еңгізіледі.

2.Оухтерлони бойынша екі қабатты диффузия әдісі: антигендер және антиденелер агарды гельдің әр түрлі шұңқырларына еңгізеді, олар диффундирлеп кездеседі, преципитат сызықтары пайда болады. Осы реакцияны қою үшін шыныларды мөлдір агарымен қүйып еңгізеді, бұл агарда сосын аралары бірдей шұңқырлар жасайды.

94

Иммунофлюоресцентті әдіс

Бұл әдіс арқылы тез арада (1-2 сағат) микробтардың әр түрлі антигендерін анықтауға болады (бактериялар, риккетсиялар, вирустар және т.б.) немесе антиденелердің тіңдерде немесе мүшелерде орналасуын табуға болады. Бұл әдісті жүргізу үшін антиденелерді немесе антигендерді флюорохромды бояулармен белгілейді. Реакция болғаннан соң препараттарды люминесценттік микроскоппен зерттейді. Антигендер боялған антиденелермен байланысып препараттың қараңгы фонында жарқырап тұрады.

Микробиологиялық зерттеулерді жүргізу үшін тура және тура емес иммунофлюоресценция әдістері қолданылады.

Практикалық микробиологияда және вирусологияда иммунофлюоресценттік әдісі көбінесе жұқпалы ауруларды анықтау үшін экспресс -әдіс ретінде қолданылады. ЖРВИ-да ИФР қою схемасын талқылау (грипп, парагрипп, аденовирустық инфекцияларды дифференциясын жасау).

Тақырыбы: Лизис, бактериолиз, комплемент байланыстыру реакциялары. Нейтралдау реакциясы. Радиоиммундық, иммуноферменттік анализдер. Бактериялардың иммобилизация реакциясы. Полимеразды тізбекті реакция.

Сабақтың оқулық мақсаты: Студент білу керек:

1.Әр түрлі тобындагы иммуноглобулиндерді, антидененің пайда болуы, иммунитеттегі антиденелердің маңызы.

2.Комплемент, иммунологиялық реакцияларьшда оның қатысуы және активтену жолдары.

Студент атқара білу керек:

1.Лизис реакциясын қою

2.Комплемент байланыстыру реакциясын қою

3.Нейтрализация реакциясын (флокуляция) қою

4.Радиоиммунды, иммуноферментті реакцияларын қою және есептеу

5.Қозгалғыш бактериялардың иммобилизация реакциясын қою

Такырып бойынша өз бетімен дайындалуға арналған сұрақтар:

1. Әр турлі топтағы иммуноглобулиндері, олардың мінездемесі. IgM,

95

IgG, IgA, IgD, IgE, S-IgA иммуноглобулиндердің молекулалық құрылысы. Активтік орталарының спецификалығы.

2.Иммунитетте антиденелердің маңызы.

3.Антиденелердің пайда болуы. Иммуногенездің фазалары. Бірінші және екінші иммундық жауаптағы антиденелердің көбеюінің ағымы.

4.Бактериялық инфекцияларда организмнің қорғанышындағы секреторлық S-IgA маңызы.

5.Иммундық лизистік реакциясы, механизмі, қажетті ингредиенттер.

6.Комплемент, оның компоненттері. Иммунологиялық реакцияларда қатысуы. Классикалық және альтернативтік жолдарымен комплементтің активтенуі.

7.Комплементті байланыстыру реакциясы (КБР). Реакцияға қатысатын жүйелер, ингредиенттері, КБР механизмі. КБР практикада қолдануы.

8.Иммуноферменттік өдіс, принципі, қолдануы.

9.Радиоиммундык өдіс, принципі, қолдануы.

Ақпараттық-дидактикалық блок

Иммунды лизис реакцясы (бактериолиз, гемолиз).

Бұл реакцияның негізінде арнайы антиденелердің (бактериолизин, гемолизиндер) корпускулярлы антигендермен (бактериялар, эритроциттер) иммунды жинақ (комплекс) түзу қасиеті жатыр. Эритроциттердің (гемолиз) немесе бактериялардың (бактериолиз) лизисімен (еруімен) және классикалық типте комплементтің белсендірілуімен қатар жүреді. Комплемент ретінде теңіз шошқасының жаңа сарысуы немесе қүрғақ "••" лиофилизация әдісімен дайындалған препарат қолданылады. Бактериолиз реакциясын қою үшін, бактериолизині бар зерттелетін сарысуға комплемент және белгілі микроорганизмдердің төуліктік дақылын қосады. Тығыз қоректік ортаға себу 2 сағат инкубациядан кейін жүргізіледі. Бактериялардың лизисі комплемент пен лизиндердің қатысуымен болады. Бұл кезде бақылау егісіне қарағанда өскен колониялардың санының тез азаюы байқалады. Бақылау егісі (төуліктік дақыл+комллемент; төуліктік дақыл+зерттелетін сарысу).

Студенттің өзіндік жұмысы

1.Лизис реакциясы пробиркада (in vitro)

2.Гемолиз реакциясына катысады: 1. Антиген - шайылган қой эритроциттері (нативті немесе консервлеген) - 0.3 мл қой эритроциттері + 9.7 мл натрий хлоридінің изотонияльгқ ертіндісі.

3.Антидене - гемолитикалық сарысу (гемолизин) қой эритроциттеріне қарсы, ертіндісі үш есе томен. Мысалы, сарысу титрі 1:1200 болганда сарысуды 400 есе ерітеді (0.1 мл сарысуға + 39.9 мл натрий хлоридішң изотонияльгқ ертіндісі).

4.Комплементті ерітеді 1:10 (0.2 мл комплемент* 1.8 мл натрий хлоридініц изотониялық ертіндісі).

96

Сабақтың сонында КБР төжірибесінің есепке алу, әр пробирканың алган

қорытындыларын талқылау — неге эритроциттердің лизисі болды? Неге болмады?

Иммуноэлектрофорез әдісі

Иммуноэлектрофорез әдісі өте сезімтал және спецификалылыгы жоғары, бұл өдіспен төмен концентрацияда және көп компоненттік жүйелерде антиген заттарды белгілеуге болады.

Иммуноэлектрофорез екі әдістің қосылуында негізделген — электрофорез және гельдегі преципитация. Әдістің қойылуы 2 сатыдан түрады.

Зерттеуге арналған затты (антигенді) олардың электрофоретикалық жылдамдық белсендігі бойынша электрофорез көмегімен гельде оның компоненттеріне бөледі. Бұл үшін ерітілген гельді шынылы пластинаға құяды, ол қатып қалған соң оның ортасында шұңқыр жасайды. Зерттеуге арналган затты шұнқырға енгізіп, пластинканы электрофорез аппаратына қояды. Зерттеу заттың компоненттері әр түрлі зоналарда тасымалдайды, оларды белгілі бояулармен анықтайды.

Электрофорезден кейін гельге иммундық сарысуын құйып преципитация реакциясын жүргізеді. Бұл үшін компоненттердің миграция жолдары бойынша гельде шұңқыр жасап, иммундық сарысуын шұңқырларға енгізеді. Антиденелер және электрофорезбен бөлінген антигендік компоненттері бір біріне қарсы гельде диффузияланады, кездеседі және ертінділі емес преципитат пайдалынады. Преципитаттар әр түрлі сызықтар болып, әр жерде орналасады. Осымен бірге әрі антиген гомологиялық антиденемен жеке байланысады да жеке сызық тудырады.

Сонымен, электрофорез өдісі зерттеу материалдың антигендік

97

компоненттерінің санын белгілейді, электрофоретикалык козғалғышы бойынша идентификацияланады және спецификалы сарысумен преципитация сызықтарының мінездемесі бойьшша.

Иммунды ферментті анализ, ИФА

Зертгелетін материалдың құрамындағы микробтың антигенін немесе сарысуындағы антиденелерді анықтауға мүмкіндік беретін - бұл қатты фазалық иммунды ферментті анализ (қатты фазалық иммунды сорбентті анализ).

Тапсырма 3.

Микробтардың антигендерін ИФА бойынша анықтау Ингредиенттері: полистиролды планшеттердің ойықтарына бекітілген

белгілі антиденелер; құрамында микробтың антигені бар зерттелетін материал; зерттелетін микробтың антигеніне пероксидазамен (Пх) белгіленген специфихалық антиденелер; ортофенилендиамин (Оф, бұл түссіз сұйық хромоген, бірақ пероксидазамен байланысса қоныр түсі пайда болады).

Полистиролды пробиркалардың қабырғасына белгілі антигенге қарсы антиденелерді (антидене қарсы антитенді) жабыстырады, зерттеуге арналған затты енгізеді, 30-40 мин 37°С инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.

Техникасы, кезендері: 1. Белгілі антиденелер бекітілген полистиролды планшеттін ойықтарына микробтың антигені бар зерттелетін материал енгізіледі. 30-40 мин. 37°С инкубацияланады. Детергент қосылган арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.

2.Пероксидазамен белгіленген антиденелер ойықтарға енгізіледі. 30-40 мин 37°С инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.

3.Ортофенилендиамин қосылғаннан кейін планшеттер бөлменің қаранғы орында 20 мин. ұсталады. Қатты фазалы ИФА нәтижесі спектрофотометр Мультискан арқылы есептеледі.

Нәтижелері: зерттелетін материалдың құрамында микробтың антигендері болғанда олар ойықтардың түбіндегі антиденелермен байланысады. Пх белгіленген антигендерімен байланысады. At + Ag - Пх комплексі түзіледі. Ақырғы кезенде ойықтарға енгізілген Оф Пх-мен байланысып қоңыр түсті болады. Бұл нәтижелі реакция.

Егер зерттелетін материалда микробтың антигендері болмаса, онда буфермен шайғаннан кейін ойықтардың түбінде тек ғана белгілі антиденелер орналасады. Содан кейін енгізген Пх-мен белгіленген антиденелерде ойықтардан буфермен шайылып кетеді. Реакцияның аяғында Оф түссіз боп қалады. Бүл нәтижесіз реакция.

б) Спецификалық антиденелерді анықтау Ингредиенттер: полистиролды планшеттердің ойықтарына бекітілген

белгілі микробты антигендер; зерттелетін сарысу; пероксидазамен бекітілген белгілі микробты глобулинге қарсы сарысу; ортофенилендиамин.

ИФА қою техникасы, кезендері: 1. Белгілі микробтың антигендері

98

бекітілген полистиролды планшеттің ойықтарына зерттелетін сарысу еңгізіледі. 30-40 мин. 37°С инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.

Пероксидазамен белгіленген АГС ойықтарға енгізіледі. 37°С 30-40 мин. инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімеи ойықтар шайылады.

3.Ортофенилендиамин қосылғаннан кейін планшеттер бөлменің қараңғы орында 20 мин. ұсталады.

4.Қатты фазалы ИФА нөтижесі спектрофотометр Мультискан арқылы есептеледі

Нөтижелері: зерттелетін сарысудын құрамында антиденелер болғанда ойықтардың түбіндегі антигендермен байланысады және буферлы ертіндімен шайылып кетпейді. Содан кейін енгізілген АГС - Пх ойықтардың түбінде қалады. Ag + At + АГС - Пх комплексі түзіледі. Енгізілген Оф Пх-мен байланысып қоңыр түсті болады. Бұл нәтижелі реакция.

Егер зерттелетін сарысудың құрамында антиденелер болмаса, онда ойықтардың түбінде тек ғана алдын ала бекітілген микробтың антигені қалады. Содан кейін енгізілген АГС - Пх буферлы ертіндімен шайылып кетеді, ал Оф түссіз боп қалады. Бүл нәтижесіз реакция.

Радиоиммунды анализ, РИА

Зерттелетін материалдың құрамындағы антигенді, сондай-ақ сарысудың құрамындағы антиденелерді анықтауға бағытталған зерттеу әдісі.

РИА өткізу үшін антиген немесе антидене радиоизотоппен танбаланады және полистиролды планшеттін ойықтарының түбіне бекітіледі.

Микробтың антигенін анықтау үшін ойықтардың түбіне изотоппен таңбаланған антиделер бекітіледі. Содан соң бекілген антиденелерге құрамында микробтың антигені бар зерттелетін материал қосылады. Антиген-антидене комплексі түзілгеннен кейін ойықтарға изотоппен таңбаланған микробтың антигені қосылады. Таңбаланған микробты антиген тек ғана алдында енгізілген антигенмен байланысқаннан кейін қалған антиденелердің активті орталықтарымен қосылады. Ойықтардың түбінде қалған антигеннің пайзын немесе изотоптың мөлшерін есептеу арқылы әдістің нөтижесі бағаланады.

Тақырыбы: Жұқпалы аурулардың иммунопрофилактикасы және иммунотерапиясы. Иммунопатология (Иммунодефицитті жағдай, жоғары сезімталдық реакциясы, аутоиммундық процестер).

Сабақтың оқулық мақсаты Студент білу керек:

1.Қазіргі заманның иммунопрофилактика және иммунотерапиясында қолданатын вакциналық препараттар, иммундық сарысулар, иммуноглобулиндер, олардың шығарып алу принциптерін.

2.Инфекцияға қарсы спецификалық және бейспецификалық қорғаныстың жалпы механизмдерін.

3.Вакциналар классификациясын.

99

4.Вакцинациядан кейін қалыптасқан иммунитеттің эффективтілігін бағалауын.

5.Тері-аллергиялық сынамалар, оның диагностикалық маңызы, микробтық антигендерін.

Студент атқара білу керек:

1.Жұқпалы аурулар диагностикасында, профилактикасында және емдеуінде антиинфекциялық иммунитеттің механизмнің білімдерін қолдану.

2.Жұқпалы аурулар диагностикасында тері-аллергиялық сынамалар қорытындысын бағалау.

Сабақ жоспары:

1.Инфекцияға қарсы спецификалық және бейспецификалық қорғаныс механизмдері схеманы талқылау.

2.Иммунды сарысулар және иммуноглобулиндер:

а) әр түрлі типті диагностикалық сарысуларын зерттеу, препараттармен танысу.

б) әр түрлі типті емдеу-профилактикалық сарысуларын және иммуноглобулиндерін зерттеу, препараттармен танысу.

3.Вакциналар: Вакциналық препараттардың талқылауы және зерттеуі, дайын вакцинаның тексеруін өткізу.

4.Иммунды реактивтілікті көтеруге арналған арнайы препараттар:

А) Адьюванттар (БЦЖ, пептидогликан, нуклеинат натрийі, жасанды полиэлектролиттер және т.б.).

Б) Иммунитеттің В- және Т-жүйесінің модуляторлары, фагоцитоздың модуляторлары (миелопид, В - активин, спленин, Т - активин, пирогенал, продигиозан және т.б.) препараттарымен танысу.

5.Ваютинациядан кейін қалыптасқан иммунитеттің тиімділігін тексеру әдістері, ТЕГР есепке алу (күл және сіреспе токсиндеріне алтиденелерді табу үшін, қызылша вирусына антиденелерді анықтау үшін); гемагглютинацияны тежеу реакциясы (ГАТР) — грипп ауруында.

6.Инфекциялық аурулар терапиясы мен сақтандыруы үшін қолданатын гомо - және гетерологиялық иммуноглобулиндерді еңгізу әдістері.

7.Жоғары сезімталдықтың баяу типін анықтап, бағалау. Инфекциялық аурулар диагностикасында қолданатын аллергендерді демонстрациясы (бруцеллин, туберкулин, тулярин, Үі-тифин және т.б.).

Тақырып бойынша өз бетімен дайындалуға арналған сұрақтар:

1.Инфекцияға қарсы қорғаныс механизмдерін атап шығыңыз.

2.Инфекцияға қарсы қорғанышындағы иммунитеттің және резистенттілік механизмдері қалай байланысады.

3.Бактериялық инфекцияларда иммундық жауаптың ерекшеліктері

қандай.

4.Вирустық инфекцияларда иммундық қорғаныстың ерекшеліктерін атап шығарыңыз.

5.Иммунитеттің қалыптасу түрлері. Антибактериялық иммунитет. Антитоксикалық иммунитет.

6.Активті иммунизация принципі неге негізделген.

100