36. Репликоны разных организмов.

Коровая часть ориджина репликации у вируса SV40 состоит из элемента опознания (ORE – origin recognition element), необходимого для связывания особого белка Т-антигена (Т-аg), элемента для связывания белка, расплетающего ДНК (DUE – DNA unwinding element), и элемента, обогащенного АТ-нуклеотидами. Участок, с которого вилка репликации начинает двигаться в противоположных направлениях, называется началом двунаправленной репликации (OBR – origin bidirectional replication).

Вспомогательные элементы (Aux) связывают димеры Т-антигена (Аux-1) и фактор транскрипции Sp1 (Аuх-2). Расстояние между этими элементами и их ориентация играют важную роль в процессе инициации репликации. Схема ориджина вируса SV40 представлена на рис. 4.

У эукариот гомологами ориджинов репликации являются автономно реплицирующиеся последовательности, или ARS (autonomously replicating sequences), открытые в 1980 г. Р. Дэйвисом и Дж. Карбоном.

У дрожжей Saccharomyces cerevisiae особые последовательности, способные обеспечивать репликацию фрагментов ДНК в дрожжевой клетке были выделены раньше, чем у других эукариот. Позднее такие последовательности были найдены и у многих других организмов. У S.cerevisiae АRS занимает 100—200пн и содержит специфическую консенсусную последовательность (АСS – ARS consensus sequence), размером в 11пн, необходимую для связывания с белком-инициатором, а также дополнительные элементы (В-элементы), усиливающие функцию ориджина. Например, АRS1 – первый подробно охарактеризованный ориджин – содержит три таких элемента – В1, В2, ВЗ. Последовательности АCS и В1 занимают приблизительно 50пн и представляют собой наименьшую функциональную область любого ориджина, которая требуется для связывания с белком-инициатором.

Элемент В2 обычно содержит генетически охарактеризованный участок DUE. Вспомогательный элемент ВЗ связывает фактор транскрипции Abf-1. Общая длина ARS-элемента составляет 100-200пн.

У другого вида дрожжей, Shizosaccharomyces pombe, ориджины состоят по крайней мере из одной ARS, которая значительно длиннее, чем у S. cerevisiae. В некоторых случаях несколько ARS-элементов формируют зону инициации репликации.

У млекопитающих ориджины детально не охарактеризованы, некоторые из них располагаются в межгенных промежутках, имеют сайты связывания для транскрипционных факторов, часто содержат только районы инициации двунаправленной репликации – OBR.

37. Репликация у эукариот. Регуляция репликации с помощью белков-циклинов.

Основные результаты получены на моделях клеток человека in vitro заражённых вирусом SV 40. Участвуют в ДНК полимераз: раскручивании, удерживании однонитчатого состояния, формировании праймеров, фрагменты Оказаки, лидирующие и отстоющие цепи.

Репликация репликации:

Участвуют белки циклины (ABDE) активирует циклин-зависимые протеинкиназы-фосфолирование специальных белков, участвующих в подготовке к делению. Циклины D регулируют переход клеток из G фазы в S фазу. Циклины А и Е активируют синтез ДНК на начальной стадии S фазы. Циклины В регулируют переход клеток из G2 фазы в М фазу.

Основные результаты по репликации получены на модельной системе с ДНК вируса SV40, в которой процесс репликации исследовали в зараженных клетках человека, культивируемых in vitro. В этой системе вирусный белок, называемый Т-антигеном, выполняет многие функции, необходимые для репликации вирусной ДНК. Во-первых, он является белком-инициатором, необходимым для инициации репликации; во-вторых, он обладает ДНК-геликазной активностью, т.е. расплетает цепи реплицируемой ДНК перед работающей ДНК-полимеразой, и, в-третьих, Т-антиген необходим для правильного взаимодействия с ДНК ферментного комплекса, синтезирующего праймеры (праймосомы). Тем не менее, вирус SV40 использует для репликации ДНК своей небольшой хромосомы и многие белки клетки-хозяина, что позволяет исследовать функционирование репликативного комплекса клеток человека в такой относительно простой системе.

У эукариот обнаружены шесть ДНК-полимераз, три из которых – α, δ и ε –непосредственно участвуют в репликации хромосомной ДНК. Аминокислотные последовательности этих трех ферментов гомологичны друг другу и последовательности продукта гена 43 бактериофага Т4.

Эукариотическая ДНК-праймаза в отличие от аналогичного белка прокариот образует постоянный комплекс с ДНК-полимеразой α, роль которого, по-видимому, ограничивается синтезом праймеров при репликации обеих цепей ДНК.

Белок PCNA и фактор репликации C (RFС) также образуют стабильный комплекс с ДНК-полимеразой δ, а в определенных условиях стимулируют и активность ДНК-полимеразы ε. Во многих отношениях PCNA и RFС являются функциональными аналогами соответственно β-белка и белков γ-комплекса E. coli, и их роль в синтезе ведущей и отстающей цепей ДНК вируса SV40 хорошо известна.

Механизмы репликации ДНК прокариот и эукариот существенно различаются в том отношении, что во втором случае синтез ведущей и отстающей цепей ДНК осуществляют разные ДНК-полимеразы (α и δ соответственно), тогда как у E. coli обе цепи ДНК синтезируются димером ДНК-полимеразы III. ДНК-полимераза α проводит инициацию синтеза ведущей цепи в точках начала репликации, а ДНК-полимераза δ осуществляет циклические реинициации синтеза фрагментов Оказаки, по-видимому, распознавая наличие 5’-концевого нуклеотида очередного праймера с последующей диссоциацией от матричной ДНК и присоединением к ней для реинициации синтеза следующего фрагмента Оказаки. Созревание фрагментов Оказаки у эукариот требует удаления РНК-затравок с помощью 5’→3’-экзонуклеазы (белковые факторы FEN-1 или MF-1) и РНКазы H1, а также ковалентного соединения фрагментов друг с другом под действием ДНК-лигазы I. Роль ДНК-полимеразы ε в настоящее время не ясна. Возможно, этот фермент непосредственно участвует в репликации или в сопряженной с репликацией репарации повреждений ДНК, а также в регуляции клеточного цикла. ДНК-полимераза ζ обнаружена в 1996 г. у дрожжей S. cerevisiae. При исследовании белков Rev3 и Rev7, которые необходимы для мутагенеза, индуцируемого в ответ на повреждения ДНК, оказалось, что их комплекс обладает ДНК-полимеразной активностью. Эта полимераза способна эффективно использовать в качестве матрицы ДНК, содержащую циклобутановые димеры. В таких условиях активность ДНК-полимеразы α составляет лишь 1% от активности ДНК-полимеразы ζ. ДНК-полимераза η, так же как и предыдущий фермент, участвует в SOS-ответе дрожжей на генотоксические воздействия. В присутствии всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов она осуществляет включение в строящуюся цепь ДНК напротив тиминовых димеров только правильных нуклеотидов (А). Поскольку ДНК-полимеразы млекопитающих лишены 3'-5'- и 5'-3'-экзонуклеазных активностей, присущих ферментам Е. coli, остается неясно, как в процессе репликации ДНК у этих организмов удаляются случайно включенные ошибочные нуклеотиды и РНК-затравки фрагментов Оказаки.

Синтез лидирующей и отстающей цепи осуществляют разные дНК-полимеразы (альфа, дельта), тогда как у E. coli обе цепи ДНК синтезируются димером ДНК-полимеразы III.

ДНК-полимераза ? проводит инициацию синтеза ведущей цепи в точках начала репликации, а ДНК-полимераза ? осуществляет циклические реинициации синтеза фрагментов Оказаки, по-видимому, распознавая наличие 5’-концевого нуклеотида очередного праймера с последующей диссоциацией от матричной ДНК и присоединением к ней для реинициации синтеза следующего фрагмента Оказаки. Созревание фрагментов Оказаки у эукариот требует удаления РНК-затравок с помощью 5’>3’-экзонуклеазы (белковые факторы FEN-1 или MF-1) и РНКазы H1, а также ковалентного соединения фрагментов друг с другом под действием ДНК-лигазы I. ДНК-полимераза ? обнаружена в 1996 г. у дрожжей S. cerevisiae. При исследовании белков Rev3 и Rev7, которые необходимы для мутагенеза, индуцируемого в ответ на повреждения ДНК, оказалось, что их комплекс обладает ДНК-полимеразной активностью. Эта полимераза способна эффективно использовать в качестве матрицы ДНК, содержащую циклобутановые димеры. В таких условиях активность ДНК-полимеразы ? составляет лишь 1% от активности ДНК-полимеразы ?. ДНК-полимераза ?, так же как и предыдущий фермент, участвует в SOS-ответе дрожжей на генотоксические воздействия. В присутствии всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов она осуществляет включение в строящуюся цепь ДНК напротив тиминовых димеров только правильных нуклеотидов (А).

38. Репликация в теломерном районе. Теломеразы – белки с обратно-транскриптазной активностью.

Синтез теломерных последовательностей ДНК осуществляется специальными ферментами – теломеразами. Особенностью этих ферментов является присутствие у них в качестве составной части короткого фрагмента РНК – компонента, служащего матрицей при синтезе теломерных последовательностей хромосом. Комплементарное взаимодействие внутренней РНК теломеразы с 3’-концевым выступающим одноцепочечным сегментом ДНК хромосомы инициирует синтез теломерных последовательностей. При этом 3’-концевой фрагмент ДНК служит затравкой для удлинения этой ДНК на РНК-матрице. После удлинения (элонгации) выступающей цепи ДНК до конца матрицы происходит транслокация фермента на один теломерный повтор вперед относительно матрицы с освобождением последовательности матричных нуклеотидов, после чего он готов для вступления в следующий цикл элонгации только что добавленной 3'-концевой последовательности хромосомы. После завершения удлинения одноцепочечной 3'-концевой теломерной последовательности вторая цепь ДНК достраивается обычным способом. Таким образом происходит решение "проблемы отстающей цепи ДНК" при репликации ДНК у эукариот. Наличие у животных тканеспецифичности в распределении теломер по размерам, а также изменение размеров этих последовательностей в онтогенезе предполагают существование механизмов, регулирующих данный процесс. Создается впечатление, что для активной пролиферации клеток теломерные последовательности не должны становиться короче определенного порогового размера. Недавние исследования обнаружили резкое повышение активности теломераз, характерное для опухолевых клеток, что служит в настоящее время чувствительным физиологическим маркером их злокачественного перерождения. В этой связи сегодня в качестве одного из подходов к терапии опухолей рассматривают подавление активности теломераз, функционирование которых, как полагают, необходимо для иммортализации клеток и роста опухолей. Именно благодаря таким свойствам теломеразы в последнее время вызывают особый интерес, что сопровождается расширением исследований в данной области молекулярной генетики.

39. Определение транскрипции. Виды транскрибируемой РНК