6.Приведите методы выделения и очистки ферментов в биотехнологическом производстве. Ответ

Ферменты – биологические катализаторы, представляют собой природные полимеры-белки, состоящие из остатков аминокислот. Каталитические функции ферментов связаны с их пространственным строением. В настоящее время ферменты получают в основном биотехнологическим методом как продукты жизнедеятельности микроорганизмов. Выделение и очистка ферментов – трудоёмкий и дорогой процесс. Как правило, выделение ферментов состоит из нескольких стадий. На первых этапах очистки используют относительно «грубые» методы – экстракция, осаждение, концентрирование, на заключительных этапах – более «тонкие» - хроматографические и электрофоретические методы.

Ферменты, растворённые в цитоплазме клеток, легко экстрагируются из них водой или разбавленными растворами солей. Ферменты связанные со структурными элементами клеток, можно выделить только после разрушения клеточной оболочки – дезинтеграции. Клетки можно разрушить механически – растирая, замораживая и оттаивая, подвергая действию ультразвука, или же ферментативно, используя специальные ферментные препараты. Для разрушения клеток иногда используют гомогенизацию со стеклянными микрошариками, которые впоследствии отделяют центрифугированием.

Если фермент содержится в липопротеидных комплексах, не растворимых в воде, липиды экстрагируют бутиловым спиртом. Фермент при этом остаётся в водном слое, а липиды - в бутанольном.

Концентрирование растворов ферментов проводят, отделяя балластные белки, всегда присутствующие в гомогенатах или цитоплазме клеток. Если фермент термостабилен, можно нагреть смесь, балластные белки подвергнутся денатурации, образуют осадок, который отделяют центрифугированием. Для коагуляции белков и очистки фермента используют также органические растворители – ацетон, этиловый спирт, метиловый спирт, диоксан. Частичное удаление балластных белков возможно и методом фракционирования (осаждения) растворами солей, например, сульфата аммония. Осадок отделяют центрифугированием и после лиофилизации надосадочной жидкости получают ферментный препарат.

Перспективным методом очистки ферментов является селективная адсорбция, при использовании каолина, трифосфата кальция, гидроокиси алюминия и др. адсорбентов которые небольшими порциями добавляются к ферментному раствору. Для десорбции (элюции) фермента из адсорбента используют специальные буферные системы.

Дальнейшую, более тонкую, очистку ферментного препарата, содержащего в небольших количествах примеси белков, проводят с использованием хроматографических методов. Используют несколько вариантов хроматографии. В ионообменной хроматографии белки связываются с ионообменником за счет электростатических взаимодействий зарядов на поверхности белковой глобулы и заряженным сорбентом. Для десорбции (элюирования) белков с поверхности ионита используют буферные системы с высокой ионной силой (обычно это растворы NaCl или KCl) или изменение рН растворителя. Другой вариант – гель-фильтрация или эксклюзионная хроматография. Этим методом можно разделить белки, отличающиеся по размеру (молекулярной массе). Крупные белки элюируются быстрее, а мелкие – задерживаются в порах сорбента и десорбируются позже. Очень перспективна аффинная хроматография, основанная на специфичном связывании фермента с рецептором или аналогом субстрата. Методом аффинной хроматографии проводят очистку генноинженерных ферментов. Так Ni-содержащие аффинные сорбенты используют для очистки ферментов со специальными «хвостами» из 6-10 остатков гистидина. Для окончательного фракционирования белков используют также электрофорез, в основе которого лежит разделение молекул белков по их заряду в электрическом поле.

Ферменты при достаточной степени очистки можно получить и в кристаллическом виде. Кристаллизацию ферментов проводят из растворов сульфата аммония, спирта или органических растворителей. К концентрированному раствору фермента осторожно по каплям добавляют насыщенный раствор сульфата аммония или спирт до появления едва заметной мути. Затем раствор на несколько дней оставляют на холоде. Выпавшие кристаллы отделяют и ведут перекристаллизацию до тех пор, пока продолжается увеличение активности фермента.

Концентрирование водных ферментных растворов и получение сухих препаратов ферментов проводят методом лиофильной (сублимационной) сушки в вакууме. Следует отметить, что упаривание воды неприменимо для растворов ферментов, так как ферменты, как правило, термолабильны. Раствор быстро замораживают в жидком азоте и подключают к вакуумной системе. В этих условиях происходит сублимация воды – переход кристаллической воды в газ. Такие лиофильно высушенные препараты достаточно стабильны.