2. Световые микроскопы. Принципы устройства простого, фазовоконтрастного, темнопольного, люминесцентного микроскопов и их применение в микробиологии. Техника иммерсионной микро­скопии.

Размеры микробов, имеющих клеточное строение, составляют 0.2 — 20 мкм (чаще 0,5 — 10 мкм) и онилегко обнаруживаются в иммерсионном микроскопе. Вирусы во много раз меньше. Диаметр самыхбольших из них, например вируса натуральной оспы, около 300 нм, а у самых мелких составляет 20 — 30нм. Ввиду этого для выявления вирусов используются электронные микроскопы.В микробиологических исследованиях применяют световые и электронные микроскопы; методыоптической и электронной микроскопии.

Оптический микроскоп. Наиболее важной оптической частью микроскопа являются объективы, которыепо способу использования и степени увеличения делятся на сухие и иммерсионные.Сухие объективы с относительно большим фокусными расстоянием и слабым увеличением применяютсядля изучения микроорганизмов, имеющих крупные размеры (более 10 — 20 мкм), иммерсионные с фокусным расстоянием 1,5 — 3 мм — при исследовании более мелких

микробов.

При микроскопии иммерсионным объективом х90 обязательным условием является его погружение вкедровое, персиковое или при их отсутствии в вазелиновое масло, показатели преломления света укоторых близки предметному стеклу, на котором делают препараты (мазки). В этом случае падающий напрепарат пучок света не рассеивается и, не меняя направления, попадает в иммерсионный объектив. Разрешающая способность иммерсионного микроскопа находится в пределах 0,2 мкм, а максимальноеувеличение объекта достигаем 1350.

При использовании иммерсионного объектива вначале центрируют оптическую часть микроскопа. Еслитубус микроскопа раздвижной, его устанавливают на длину 160 мм, затем поднимают конденсор доуровня предметного столика, открывают диафрагму, устанавливают объектив х8 и при помощи плоскогозеркала освещают поле зрения. На предметное стекло с окрашенным препаратом наносят каплю масла, вкоторую под контролем глаза осторожно погружают объектив, затем, поднимая тубус, смотрят в окуляр ивначале макро-, а потом микровинтом устанавливают четкое изображение объекта. По окончании работыподнимают тубус, снимают препарат, салфеткой удаляют масло с фронтальной линзы объектива, отводятего в сторону и опус кают к предметному столику.

Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Это достигается с помощью пара­болоид- или кардиоид-конденсора, который заменяет обычный конденсор в биологическом микроскопе.

Фазово-контрастная микроскопия. Основана на превращении изменений по фазе, возникающих при прохождении световой волны через так называемые фазовые (прозрачные) объекты, в изменения по амплитуде, которые улавливаются глазом. С помощью фазово-контрастного приспособления фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, превра­щаются в амплитудные и прозрачные объекты становятся видимыми в микроскоп. При этом они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негатив ным фазовым контрастом — светлое изображение объекта на темном фоне.

Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное приспособле­ние КФ-1 или КФ4.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Основана на явлении фотолюминесценции. Первичная (собственная) люминесценция наблюдает­ся без предварительного окрашивания объекта, вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов специаль­ными люминесцирующими красителями — флюорохромами. Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: возможностью исследова­ния живых микроорганизмов и обнаружения их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности.

В лабораторной практике люминесцентная микроскопия широко применяется для выявления и изучения многих микроорганизмов.