- •Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
- •Введение
- •1.Общие свойства моноклональных антител
- •2. Применение моноклональных антител
- •2.1.Клиническая диагностика растворимых антигенов.
- •2.2.Дигностика вирусов, бактерий и паразитов
- •2.3. Применение моноклональных антител в терапии
- •3.Основные этапы получения моноклональных антител методом гибридомной технологии
- •4. Иммунизация
- •4.1.Выбор объекта иммунизации.
- •4.2.Схемы иммунизации мышей
- •4.3. Предварительная обработка антигенов перед иммунизацией
- •5. Гибридизация в-лимфоцита с клеткой миеломы.
- •6. Культивирование гибридом in vitro и in vitro
- •7. Методы селекции слившихся клеток
- •7.1. Использование селективных сред.
- •7.2.Использование проточного цитофлуориметра.
- •9. Клонирование гибридом
- •9.1. Метод клонирование вмягком агаре
- •9.2. Клонирование методом предельных разведений.
- •9.3. Клонирование с помощью приборов
- •10. Наработка гибридомных клеток и секретируемых ими антител
- •10.1. Наработка на культуральных средах в со2 инкубаторе
- •10.2. Наработка антител в асцитных жидкостях
- •Контрольные вопросы
- •Список рекомендованной литературы.
3.Основные этапы получения моноклональных антител методом гибридомной технологии
В 1984 г. за открытие принципа получения моноклональных антител Мильштейн, Кёлер и Ерне получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.
Лабораторные животные (млекопитающие, например, мыши) подвергаются иммунизации, обычно, путем нескольких инъекций антигена в течение 1-2 месяцев. Затем из селезенки получают клетки, из которых выделяют лимфоциты. Их сливают с клетками миеломы, которую выбирают так, чтобы она сама по себе не производила антитела и не имела гена гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (ГГФТ), что делает ее чувствительной к селектирующему агенту НАТ. Слияние клеток производится с помощью нарушающего мембраны агента, такого, как полиэтиленгликоль или вирус Сёндай.
После слияния клетки в течение 10-14 дней поддерживают в среде, содержащей НАТ (гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Аминоптерин блокирует синтез нуклеотидов, поэтому клетки материнской миеломы погибают. В отличие от миеломы, гибридные клетки и В-лимфоциты, имеющие ген ГГФТ, выживают за счет использования гипоксантина как источника пуринов, но продолжительность жизни обычных лимфоцитов ограничена, и через несколько недель в культуре остаются только клетки гибридомы. Поскольку не все из них образованы путем слияния миеломы с лимфоцитами, производящими нужные антитела, клетки делят на линии, которые поддерживают в отдельных ячейках 96-луночных плашек. Далее в среде над клетками определяют антитела и отбраковывают клеточные линии, не производящие антитела или недостаточно быстро размножающиеся. При достаточно хорошем разведении клеточной суспензии в одну лунку попадает не более одной гибридной клетки, но для гарантированного качества и стабильности культуры отобранные клеточные линии могут быть еще раз клонированы с тем, чтобы антитела производились потомками одной гибридной клетки, то есть были моноклональными.
Клонированную культуру гибридомы затем пересевают из лунки 96-луночной плашки в сосуды большей емкости для размножения, хранения в жидком азоте и получения большего количества антител для дальнейших исследований. Из культуральной среды можно получить от 1 до 60 µg/ml моноклональных антител. Большее количество можно получить путем введения клеточной суспензии в брюшную полость мышей, где гибридома размножается подобно раковым клеткам материнской миеломы, секретируя антитела во внутриполостную жидкость с образованием асцита (скопление жидкости в брюшной полости).
Секрецию антител определяют различными методами скрининга супернатантов гибридом, другими словами, проводят анализ той культуральной среды, в которой рос конкретный клон. При наличии в супернатанте желаемых антител проводят еще одно или несколько клонирований, затем клетки нарабатывают для получения большего количества антител либо в культуре, либо в перитонеальной полости мышей (крыс). Далее антитела выделяют из культуральной или асцитной жидкости и проводят более детальные исследования на предмет их пригодности для использования в тех целях, для которых монАТ были получены. Клетки–продуценты можно заморозить и хранить в жидком азоте долгое время.