Методическое пособие биохимия человека

Таким образом глицерол и промежуточные продукты гликолиза легко подвергаются взаимопревращению.

4. Открытие ненасыщенности жирных кислот в жире.

(Работа только оформляется).

В две пробирки наливают по 1 мл бромной воды (яд!). В первую пробирку добавляют несколько капель растительного масла и тщательно встряхивают; наблюдают обесцвечивание бромной воды. Вторая пробирка служит контролем. Результаты опыта и уравнение реакции записывают.

5. Получение нерастворимых солей высших жирных кислот.

Реактивы: раствор мыла; гидролизат масла; хлористый кальций, 10% раствор.

Ход работы: В пробирку наливают 1-2 мл раствора мыла, во вторую — гидролизат, полученный во втором опыте и прибавляют несколько капель 10%раствора хлористого кальция. Тщательно перемешивают и наблюдают появление осадка нерастворимого кальциевого мыла. Результат опыта и уравнение реакции записывают.

6. Гидролиз лецитина (фосфатидилхолина).

Принцип метода. Фосфатидилхолины содержат в своем составе аминоспирт холин, который является сильным основанием, полностью диссоциирует в водной среде. Фосфатидилхолин имеет следующее строение:

ЛЕЦИТИН

Реактивы: лецитин; едкий натрий, 10% раствор.

Ход работы: В фарфоровую чашку наливают примерно 1 мл спиртового раствора лецитина и добавляют равное количество 10% раствора едкого натра. Кипятят в течение 2-3 мин, помешивая стеклянной палочкой. Образования триметиламина обнаруживается по запаху селедочного рассола. Результат опыта и уравнение реакции записывают.

7. Цветные реакции на холестерин

Холестерин относится к группе стероидов, являющихся производными циклопентанпергидрофенантрена

61

R C O

O

ХОЛЕСТЕРИН

Реактивы: хлороформный раствор холестерина; конц. H2SO4, уксусный ангидрид

Ход работы.

Проба Сальковского. К раствору холестерина прибавляют равный объем концентрированной серной кислоты и тщательно смешивают. После отстаивания верхний хлороформенный слой жидкости оказывается окрашенным в красный цвет; нижний слой (H2SO4) желтокрасного цвета, обладающий зеленой флюоресценцией.

Проба Либермана – Бурхарда. К 2 мл раствора холестерина добавить 10 капель уксусного ангидрида, 1-2 капли серной кислоты и хорошо перемешать. Жидкость принимает сначала красную, затем синюю и, наконец, зеленую окраску. При малых концентрациях холестерина может сразу появиться зеленая окраска.

Проба Шиффа. В пробирку наливают 1 мл хлороформного раствора холестерина и добавляют по стенке 1 мл конц. серной кислоты. На границе двух жидкостей появляется кольцо красного цвета (необходимо соблюдать осторожность при приливании серной кислоты, иначе жидкость может выплеснуться из пробирки!).

Вопросы для самоконтроля:

1.Напишите строение смешанного глицерида, образованного глицерином, а также стеариновой, олеиновой и линоленовой кислотами.

2.С помощью каких реакций можно определить составные части лецитина?

3.Какова химическая природа холестерина и холестеридов?

4.Что такое омыление жиров?

5.Как можно определить составные части жира?

62

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 9

УГЛЕВОДЫ.

Теоретическая часть.

Углеводами называются альдегиды или кетоны многоатомных спиртов и полимеры этих соединений. Общая формула углеводов Cn (H2O) n. Обширная группа углеводов может быть подразделена на три класса: моносахариды, олигосахариды и полисахариды.

Моносахариды – простейшие углеводы – представляют собой соединения, характеризующиеся смешанными функциями и содержанием одновременно гидроксильных и карбонильных групп. Образуют таутомерные формы циклических полуацеталей. В зависимости от характера группы различают альдозы (полигидроксиальдегиды) и кетозы (полигидроксикетоны). Наиболее распространенными из моносахаридов в физиологическом отношении являются гексозы. Среди них глюкоза (виноградный сахар, декстроза) и фруктоза (плодовый сахар, левулоза).

H––C––O H2––C––OH

Свойства моносахаридов связаны с их структурным строением, т.е. наличием в их

молекуле спиртовых и альдегидных групп. Как спирты они образуют алкоголяты. Как альдегиды они способны к реакции полимеризации и реакциям восстановления металлов и окисления углевода.

Олигосахариды (от греч. «олигос» — немногий) – полные ацетали, образуются с выделением воды из двух или нескольких (до десяти) молекул моносахаридов. По своему строению олигосахариды являются гликозидами. Олигосахариды сравнительно легко гидролизуются с образованием соответствующих моносахаридов. Они дают истинные растворы, обладают, подобно маннозам, сладким вкусом и обычно хорошо кристаллизуются. В зависимости от числа остатков моносахаридов, входящих в молекулы олигосахаридов, последние делят на дисахариды, трисахариды и т.д. Широко распространенной группой являются дисахариды.

Дисахариды, построенные из молекул гексоз, встречаются в организмах растений (например, сахароза, мальтоза) и животных (лактоза, мальтоза). Дисахариды построены по типу гликозидов. Это означает, что при образовании дисахарида одна молекула

63

моносахарида образует связь с другой молекулой за счет своего гликозидного гидроксила. Вторая молекула моносахарида участвует в образовании связи двумя путями: 1) спиртовым гидроксилом; 2) гликозидным гидроксилом. В первом случае в молекуле дисахарида остается свободным гликозидный гидроксил, благодаря чему эти дисахариды обладают восстанавливающими свойствами (мальтоза, лактоза, целлобиоза). Во втором случае в молекуле дисахарида нет свободного гликозидного гидроксила, вследствие чего он лишен восстанавливающих свойств (сахароза, трегалоза).

Полисахариды являются полимерными соединениями, построенными по тому же принципу, что и олигосахариды. Они имеют высокий молекулярный вес. Нерастворимы в воде или дают коллоидные растворы, аморфны. Полисахариды не обладают сладким вкусом. В результате гидролиза в качестве промежуточных продуктов образуют олигосахариды, а в качестве конечных продуктов моносахариды. В организмах растений очень распространены крахмал и клетчатка, состоящие из молекул гексоз, реже встречается инулин, построенный из молекул фруктозы в организмах животных представлен полисахарид гликоген, близкий по своему строению к крахмалу. В полисахаридах гликозидный гидроксил одной молекулы моносахарида соединен со спиртовым гидроксилом второй молекулы через гликозидную связь. Полисахариды имеют свободный тликозидный гидроксил на большое число молекул моносахарида, поэтому они практически не проявляют восстанавливающих свойств.

Практическая часть.

1. Доказательство наличия гидроксильных групп Реактивы: глюкоза, 5%-ный раствор; NaOH, 30%-ный раствор;

HCl, 10%-ньй раствор; CuSO4, 1%-ный раствор.

Ход работы: К 3мл раствора глюкозы прибавляют на 1/3объема раствора NaOН и по каплям 1%-ный раствор CuSO4. Образующийся гидрат окиси меди при наличии сахара растворяется, окрашивая жидкость в синий цвет.

CuSO4 + 2NaOH = Cu (OH)2 + Na2SO4

2. Доказательство наличия карбонильных групп (альдегидная проба Мура).

Реактивы: глюкоза, 5%-ный раствор; NaOH, 30%-ный раствор; HCl, 10%-ньй раствор; CuSO4, 1%-ный раствор.

Ход работы: В пробирку наливают 2-3мл раствора глюкозы и столько же раствора NaОН. Жидкость нагревают до кипения. Появляется сначала желтое, а затем темно-бурое окрашивание и запах карамели, делающийся более заметным при подкислении жидкости, разбавленной серной кислотой. Побурение раствора и появление запаха карамели зависит от образования продуктов полимеризации альдегидов.

64

O O

CH2OH(CHOH)4C + 2CuSO4 + 5NaOHCH2OH(CHOH)4С + 2Сu(OH)2 + 2Na2SO4 + 2H2O

2Cu(OH)2 Cu2O+ 2H2O

Реактивы: глюкоза, 5%-ный раствор; NaOH, 10%-ный раствор; CuSO4, 5%-ный раствор.

Ход работы: В пробирку к 3мл раствора глюкозы добавляют растворы гидроксида натрия (1мл) и сульфата меди (5 капель). Выпадает осадок гидроксида меди (II), который при перемешивании или встряхивании пробирки растворяется, и раствор приобретает голубой цвет. Верхний слой жидкости осторожно нагревают в пламени горелки до кипения. Появление желтого осадка гидроксида меди (I), а затем и красного осадка гемиоксида меди указывает на окисление глюкозы и восстановление меди.

3б. Проба Фелинга.

Принцип метода. В реактиве Фелинга ионы меди (II) находятся в виде комплексного соединения с тартратами. Механизм реакции гексоз (и всех редуцирующих углеводов) с реактивом Фелинга такой же, как в реакции Троммера. Преимуществом реактива Фелинга является то, что медь при избытке реактива не выпадает в виде окиси меди (II). Дисахариды и полисахариды взаимодействуют с реактивом Фелинга после кипячения с минеральными кислотами. Жидкость Фелинга представляет собой медный алкоголят сегнетовой соли:

COOK

CHO

Cu

CHO

COONa

Реактивы: глюкоза, 5%-ный раствор; реактив Фелинга.

Ход работы: В пробирку вносят 1мл раствора глюкозы и 1мл реактива Фелинга. Смесь перемешивают и нагревают на пламени горелки до кипения. Наблюдают образование красного осадка гемиоксида меди. Кислород идёт на окисление углевода.

3в. Получение серебряного зеркала.

Принцип метода. Глюкоза восстанавливает аммиачный раствор серебра, образуемый при взаимодействии нитрата серебра с гидроксидом натрия и водным раствором аммиака, до металлического серебра:

66

AgNO3 + 3NH4OH [Ag(NH4)]OH + NH4NO3 + 2H2O

2[Ag(NH4)]OH + 3H2O Ag2O + 4NH4OH

C6H12O6 + Ag2O CH2OH(CHOH)4COOH + 2Ag

Реактивы: глюкоза, 1%-ный раствор; аммиачное азотнокислое серебро, 1%-ный раствор.

Ход работы: В пробирку наливают 2мл 1% раствора глюкозы и 1мл аммиачного раствора азотнокислого серебра. Осторожно нагревают. Стенки пробирки покрываются слоем металлического серебра.

3г. Проба Подобедова — Молиша с α- нафтолом.

Принцип метода. Реакция α- нафтолом является общей для всех моносахаридов. При взаимодействии их с концентрированной серной кислотой из пентоз образуется фурфурол, а из гексоз — омсиметилфурфурол В присутствии α-нафтола как фурфурол, так и оксиметилфурфурол дают лейкосоединение (бесцветное), а это лейкосоединение окисляется серной кислотой в окрашенное хиноидное соединение (красно-фиолетового цвета).

Реактивы: глюкоза, 1% раствор; 10% спиртовой раствор α- нафтола; концентрированная серная кислота.

Ход работы: В пробирку помещают 1мл 1% раствора глюкозы, 2капли 10% спиртового α-нафтола и по стенке пробирки осторожно приливают 2мл концентрированной серной кислоты. Серная кислота опускается на дно пробирки, и на границе двух жидкостей образуется кольцо красно-фиолетового цвета.

3д. Проба Барфеда.

Принцип метода. Гексозы в реакции с ацетатом меди приводят к образованию гемиоксида меди. Суммарное уравнение реакции для глюкозы имеет вид

O O

CH2OH(CHOH)4C + 2Cu(CH3COO)2 + 2H2O CH2OH(CHOH)4С + Сu2O + 4CH3COOH

Эта реакция протекает в среде со значением рН, близким к нейтральному (7,0). В этих условиях редуцирующие дисахариды не окисляются, что дает возможность отличить их от моносахаридов.

Реактивы: глюкоза, 5%-ный раствор; реактив Барфеда.

Ход работы: В пробирку вносят 1мл раствора глюкозы и 1мл реактива Барфеда. Смесь перемешивают и осторожно нагревают, в пламени горелки до кипения. Наблюдают образование красного осадка гемиоксида меди.

67

4. Качественные реакции на дисахариды

4а. Реакции на сахарозу.

Принцип метода. Сахароза не восстанавливает окислов металлов, но если на раствор сахарозы подействовать кислотой, то происходит расщепление сахарозы на глюкозу и фруктозу, которые способны восстанавливать окислы металлов.

Реактивы: сахароза, 5%-ный раствор; HCl (конц.); NаОН 5%-ный раствор; СuSO4, 1%-ный раствор; СоSО4, 2%-ный раствор.

Реакции восстановления металлов. В две пробирки вносят по 3мл 5%-ного раствора сахарозы. В одну из них добавляют 1-2 капли концентрированной соляной кислоты и нагревают пробирку 15 минут на водяной бане при 1000С. Вторая пробирка служит контролем. Затем в обе пробирки добавляют по 2 мл 5%-ного раствора гидроксида натрия или гидроксида калия, по 5 капель 1%-ного раствора СuSO4 и нагревают. В первой пробирке, где произошло расщепление сахарозы, образуется закись меди, во второй — закиси меди не образуется.

Реакция с солями кобальта. В пробирку с 2 мл 5%-ного раствора сахарозы добавляют 1 мл 5%-ного раствора NаОН и несколько капель 2%-ного раствора азотнокислого кобальта. Раствор приобретает фиолетовое окрашивание.

4б. Реакция на мальтозу и лактозу Принцип метода. В зависимости от способа соединения молекул

моносахаридов друг с другом, дисахариды обладают, или же наоборот не обладают, редуцирующими свойствами. Мальтоза и лактоза имеют в своей молекуле по одной свободной альдегидной группе и обладают редуцирующими свойствами; сахароза не имеет свободной ни альдегидной, ни кетонной группы и этими свойствами не обладает.

Реактивы: мальтоза или лактоза, 5%-ный раствор; NаОН, 5%-ный раствор; СuSO4, 5%-ный раствор.

Ход работы: В пробирку с 5 мл 5% раствора мальтозы или лактозы добавляют 1 мл 5% раствора NаОН и 5 капель 5% раствора сульфата меди, нагревают. Выпадает красный осадок закиси меди. Для сравнения ту же реакцию проводят с сахарозой.

5. Цветные реакции на крахмал и гликоген.

Реактивы: крахмал и гликоген, 0,1%-ные растворы; реактив Люголя; NаОН, 10%-ный раствор.

Ход работы: В две пробирки наливают по 2-3 мл 0,1% раствора крахмала и гликогена; добавляют 1-2 капли раствора Люголя. Перемешивают. Содержимое пробирок приобретает синий цвет в случае с крахмалом и красно-бурый цвет в случае гликогена. Окрашивание нестойкое и исчезает при нагревании, но появляется опять при охлаждении. Обесцвечивание происходит также при добавлении гидроксида натрия или калия. Можно проверить, разделив

68

содержимое пробирок пополам. Исчезновение окраски при нагревании и добавлении щелочи обусловлено тем, что в образовании комплексов принимает участие молекулярный иод, а не иодит-ионы.

6. Гидролиз крахмала.

Принцип метода. При нагревании раствора крахмала с минеральными кислотами происходит гидролиз крахмала с образованием глюкозы, которую можно обнаружить характерными реакциями на моносахариды, в частности реакцией Троммера.

Реактивы: крахмал, 1%-ный раствор; HCl (конц.); NаОН, 10%-ный раствор; СuS04,1%-ньй раствор.

Ход работы: В две пробирки помещают по 5 мл раствора крахмала. В одну из них вносят также 2-3 капли концентрированной соляной кислоты и кипятят на водяной бане 15 минут. Вторая пробирка служит контролем, затем в обе пробирки приливают по 2 мл 10% раствора гидроксида натрия, и по 5 капель раствора сульфата меди и нагревают (проделывают реакцию Троммера). В пробирке, где проводился гидролиз крахмала соляной кислотой, при нагревании наблюдают образование красного осадка гемиоксида меди (реакция Троммера положительная), а в контрольной пробирке такой осадок не образуется (реакция Троммера отрицательная).

7. Гидролиз клетчатки.

Принцип метода. Гидролиз клетчатки минеральными кислотами происходит значительно медленнее, чем крахмала. Если же клетчатку предварительно обработать 80 % раствором серной кислоты, то процесс гидролиза клетчатки значительно ускоряется.

Реактивы: вата (источник клетчатки); Н2SO4, 3%-ный и 80%-ный растворы; реактив Фелинга и Барфеда.

Ход работы: Небольшое количество ваты (100-200 мг) помещают в пробирку, заливают 3% раствором серной кислоты и кипятят на водяной бане 10 минут. После нейтрализации содержимое пробирок разделяют на две части. В другой пробирке то же количество ваты предварительно обрабатывают небольшим количеством (примерно 0,5 мл) 80% раствора серной кислоты до полного растворения, затем разбавляют водой до объема 1 мл и кипятят на водяной бане в течение 5 минут. После нейтрализации содержимое пробирки делят также на две части.

С одной частью смесей, содержащих обработанную и необработанную вату, проводят реакцию Фелинга (добавляют по 1 мл раствора Фелинга и после перемешивания нагревают до кипения), а с другой частью этих смесей — реакцию Барфеда (добавляют по 1 мл раствора Барфеда и после перемешивания нагревают до кипения).

В пробирках, где находилась необработанная серной кислотой вата, наблюдается отсутствие осадка красного цвета (отрицательные реакции Фелинга и Барфеда).

69

В пробирках, содержащих предварительно обработанную вату, возникает красный осадок гемиоксида меди (положительные реакции Фелинга и Барфеда), что свидетельствует об образовании глюкозы.

Вопросы для самоконтроля:

1.Какими общими химическими свойствами обладают моносахариды и почему?

2.Какие методы служат для качественной оценки содержания моносахаридов?

3.В чем сущность проб Троммера, Фелинга и Барфеда?

4.На чем основано получение серебряного зеркала?

5.Раскройте понятие редуцирующих сахаров. Приведите примеры.

6.Каковы структурные различия крахмала, гликогена и целлюлозы?

70