9. Использование микробных почвоудобрительных препаратов

Витамины выделяются как живыми бактериями и грибами, так и отмершими микробными клетками. Некот-е витамины выд-тся корнями растений. Больше всего микроорг-мы обр-ют тиамина, рибофлавина, никотиновой, аскорбиновой кислоты, пиридоксина и др. Их содержание в почвах колеблется в зависимости от типа почвы, состава почвенной микрофлоры, степени окультуренности и т.д. Витамины оказывают большое влияние на развитие корневой системы растений. Например, при недостатке тиамина плохо развиваются корневые системы льна и др.раст. Для гороха, люцерны и других культур необходима никотиновая кислота.

Отдельные виды плесневых грибов выделяют антибиотики (пенициллин), актиномицеты – стрептомицин, левомицетин и т.д. Поступая в клетки растений, антибиотики повышают бактерицидные свойства клеточного сока. Растения становятся устойчивыми против инфекционных заболеваний, повышается их иммунитет. Технология эффективных микроорганизмов (ЭМ-технология) была разработана в Японии в 80-х годах. ЭМ препараты предст. собой концентрат из 84 микроорг-мов, противоположных по способу обмена в-в и способу существования, причем отходы или продукты жизнедеятельности одной группы микробов дают питание или утилизируются другой группой, при этом в почве накапливаются полезные для растений вещества – ферменты, аминокислоты, нуклеиновые кислоты и другие биологические вещества.

10. Методы рекомбинантных ДНК

Процесс конструирования рекомбинантных ДНК предполагает существование:

1. Четких представлений о молекулярных механизмах функционирования генов, подлежащих клонированию.

2. Способов выделения этих генов из живых объектов или их химического синтеза.

3. Методических возможностей сшить нужные гены в нужной последовательности с выполнением правил, обеспечивающих эффективную экспрессию.

4. Методов введения рекомбинантных ДНК в рецепиентный организм.

Любая схема манипуляций генной инженерии содержит следующие этапы:

1. Получение фрагментов ДНК (генов), содержащих определенную информацию

2. Включение фрагмента ДНК в вектор

3. Введение вектора в клетку хозяина

4. Экспрессия.

С момента введения рекомбинантной ДНК в клетку начинается молекулярное клонирование.

К наиболее важным методам биотехнологии рекомбинантных ДНК относятся следующие:

1. Специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нуклеазами.

2. Быстрое секвинирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющее определить точные границы гена.

3. Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявить специфические нуклеотидные последовательности на основе их способности связывать комплементарные основания.

4. Клонирование ДНК, позволяет ввести ДНК – фрагмент в самореплецирующий генетический аппарат.

5. Генетическая инженерия – модификация версии генов и их внедрение в клетку или организм.

11. Клонирование и экспрессия генов в различных организмах. На сегодня разработаны системы клонирования в различных бактериях, растениях и клетках млекопитающих. Клонирование в бактериях используется в промышленности для многих целей, в том числе и для получения продуцентов антибиотиков.

Клонирование ДнК, суть которого сводиться к введению ДНК-фрагмента в самореплецирующийся ген.аппарат (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная кл.после трансформации способна воспроизводить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий.

12. Ферменты,использум в биотех. рекомб. ДНК.Ф-ты, примен. при констр-ии рекомб-х ДНК, дел на группы: 1) с помощью кот-х получают фрагменты ДНК (рестриктазы); 2) синтезир. ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);3) соединяющ. фрагменты ДНК (лигазы); 4) позволяющ. Осущ-ть изм-ие струк-ры концов фрагментов ДНК. Рестриктазы - узнающие и атакующие определ последоват-ти нуклеотидов в молекуле ДНК. Разные бактерии по-разному метят свою ДНК, то и рестриктазы должны узнавать разные послед-ти. Полимеразы:Фермент состоит из мономерной полипептидной цепи имеет 3-х доменную структуру. Обратная транскриптаза использ для транскрипции м-РНК в комплем цепь ДНК.РНК-зависимая ДНК-полимераза получила название обратная транскриптаза, или ревертаза. Обратная транскриптаза обладает тремя ферментативными активностями: 1) ДНК-полимеразной, использ в качестве матрицы как РНК, так и ДНК; 2) активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК - ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК; 3) ДНК-эндонуклеазной активностью.ДНК-лигазы сшивают рядом расположенные нуклеотиды, образуя связь между остатками сахаров.

№13.Векторы – это небольшие молекулы ДНК, способные переносить, размножать и хранить генетическую информацию. При обычном попадании рекомбинантной ДНК в микробную клетку происходит ее разложение внутриклеточными нуклеазами.Векторные молекулы ДНК после введения в клетку способны к автономному существованию, как самостоятельные мини-хромосомы и при последующих делениях клетки реплицируются и стабильно поддерживаются.

Идеальный вектор для молекулярного клонирования должен иметь точку начала репликации (ori). Вектор должен содержать сайты рестрикции. При помощи такого вектора можно умножать гены (ДНК). Чтобы ген экспрессировался, вектор должен содержать специфические для данной клетки промоторы и терминаторы («стоп»-кодоны) транскрипции. Вектор должен содержать минимальное количество собственной ДНК, необходимой для его функционирования.В качестве векторов используют небольшие по размерам молекулы ДНК плазмид, вирусов, бактериофагов.

Наиболее часто в качестве векторов используют плазмиды, выделенные из бактерий.

№14

Используемые плазмидные векторы поддерживаются в клетке в количестве 25—50 копий, но, но их количество может колебаться от одной до более ста. В целом, чем крупнее плазмида, тем меньше количество ее копий в клетке. Первый плазмидный вектор был выделен из E.coli. Наряду с Е. coli, плазмидные векторы получены от Bacillus subtilis и Saccharomyces cerevisiae и других микроорганизмов.

Плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и др. Гены устойчивости к тяжелым металлам обнаружены также в составе R-плазмид Е. coli, у разных видов Е. coli, Salmonella, Saccharomyces обнаружены Col-плазмиды, обеспечивающие синтез высокоспецифичных антибиотиков.

Наиболее емкими по возможности включения чужеродной ДНК являются космидные векторы. Они созданы на основе совмещения в одном геноме плазмидного гена репликатора и cos-сайта фага лямбда. Фаговые и космидные векторы с включенными в них генами, если последние упакованы в инфекционной фаговой частице, можно вводить в бактериальную клетку путем естественного проникновения фага в клетку. Внесение чужой ДНК в клетку при помощи фага называется трансдукцией. Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными или химерными. Космиды являются гибридными векторами, состоящими из плазмидной ДНК и фрагментов ДНК фага λ. Плазмидная составляющая содержит уникальные сайты рестрикции и селективные маркеры, а фаговая – соединенные липкие концы (cos-сайт). Фазмиды, также как и космиды, являются гибридами плазмид и фага, однако в отличие от космид, в них сохранены функции репликации как плазмиды, так и фага. Фазмиды представляют собой линейные молекулы ДНК, на концах которой находятся сегменты ДНК фага λ. Фазмиды в одних условиях могут размножаться как плазмиды, а в других – как фаги. Размножение фазмиды как фага, заканчивается лизисом клеток и выходом фаговых частиц из клетки.

№15.Получение трансгенных растений

Генно-инженерные методы, позволяют создавать новые генотипы и, следовательно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классические методы селекции. В сельскохозяйственные растения можно ввести гены устойчивости к стрессовым факторам, фитопатогенам, гербицидам и пестицидам, гены скороспелости.

Генетическая трансформация заключается главным образом в переносе чужеродных или модифицированных генов в клетки эукариот и получении растений из трансформированных клеток при регенерации. Получение растений с новыми свойствами (трансгенных растений) из трансформированных клеток возможно благодаря их свойству тотипотентности, т.е. способности клеток развиваться в целое растение. Перенос генов в растительные клетки, и их встраивание в геном растений (трансформация) осуществляются благодаря специфическим векторам-переносчикам, сконструированным на основе плазмид, вирусов, хлоропластной и метохондриальной ДНК и др. Наиболее широкое применение получили векторы на основе Ti-плазмид, выделенных из некоторых видов агробактерий. Ti-плазмиды — это естественные векторы, обладающие всеми функциями, необходимыми для переноса, стабильного включения и экспрессии генетической информации в растениях. Они имеют широкий круг хозяев и различаются по типу кодируемых опинов — белков, которые используются бактериями в качестве источников азота и углерода. Различают два типа опинов: либо октопин (октопиновая плазмида), либо нопалин (нопалиновая плазмида). Кроме плазмид в качестве векторов применяют ДНК-содержащие вирусы растений. Существуют так же методы прямого переноса генов в растения. К ним относятся:

1. Трансформация растительных протопластов. 2. Культуру протопластов на начальной стадии ее роста заражают агробактериями, которые используют в качестве векторов. 3. Микроинъекции ДНК. 4. Метод электропорации. Основан на повышении проницаемости биомембран за счет действия импульсов высокого напряжения. 5. Упаковка в липосомы: один из методов, позволяющих защищать экзогенный генетический материал от разрушения нуклеазами растительной клетки.

16. Применение методов генет-кой инженерии для улучшения аминокислотного состава запасных белков растений.

Применение методов генной инженерии позволяет повысить качество синтезируемых растением продуктов, которые определяют его питат-ную и техническую ценность.

В большинстве случаев запасные белки растений имеют несбалансированный для питания человека и животных аминокислотный состав. Так, запасные белки злаков (проламины) бедны лизином и триптофаном, а белки бобовых бедны метионином и цистеином.

Генно-инженерные методы более перспективны для создания улучшенных сортов, т.к. позволяют избирательно вводить в геном растения-реципиента гены искомого признака. Для решения проблемы может быть использовано несколько подходов: введение в белок кодонов, кодирующих дефицитные аминокислоты; изменение регуляции биосинтеза аминокислот; введение новых генов запасных белков и др. Так, например, были получены трансформанты кукурузы с модифицированным α-зеином. Клонированы многие запасные белки у таких культур, как соя, горох, фасоль, картофель. Для улучшения пит-ных качеств семян с/х культур можно использовать гены из др. растений, кодирующих высококачественные запасные белки. Наряду с улучшением аминокислотного состава белков проводятся работы по созданию растений с измененным содержанием углеводов. Например, созданы трансгенные растения картофеля, в клубных которого наблюдается повышенное содержание крахмала. Получены трансгенные растения сахарной свеклы с геном артишока, которые кодируют полимерами фруктозы.