ОФС / 1. Хроматография

Общие фармакопейные статьи

МЕТОДЫ АНАЛИЗА

ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

1. хроматогрАфия (ОФС 42-0092-09)

Хроматографией называется физико-химический метод разделения смесей, в котором разделяемые компоненты распределены между двумя фазами. одна из этих фаз (стационарная фаза) неподвижна, а другая (подвижная фаза) постоянно движется в определенном направлении.

по свойствам подвижной и неподвижной фаз хроматографические методы можно разделить на следующие типы, показанные на схеме (рис. 1.1).

Рис. 1.1. Типы хроматографии

Результат хроматографического разделения представляется в виде хроматограммы.

Хроматограмма и хроматографичеcкие параметры

Хроматограммой называют последовательность пятен, зон или пиков, соответствующих компонентам исходной смеси после их хроматографического разделения. Для любого типа хроматографического процесса (см. рис. 1.1), в котором для регистрации результата используется детектор, хроматограмма представляет собой график зависимости сигнала детектора, пропорционального концентрациям разделяемых компонентов, от времени (колоночная хроматография) или расстояния (планарная хроматография). В планарной хроматографии хроматограммой называют также зафиксированную на бумаге (бумажная хроматография) или на ТСХ-пластинке (тонкослойная хроматография) последовательность пятен компонентов исходной (анализируемой) смеси.

Схема типичной хроматограммы приведена на рис. 1.2. Хроматограмма состоит из пиков, разделенных базовой линией.

Базовая линия соответствует сигналу только от подвижной фазы.

Пик – кривая, в идеале приближающаяся к кривой гауссова распределения, которая описывает постепенное нарастание концентрации вещества и последующее ее уменьшение.

Рис. 1.2. Хроматограмма и основные хроматографические параметры

1 и 2 – пики соединений 1 и 2; t₁ и t₂ – соответствующие времена удерживания; t₀ – время удерживания несорбирующегося компонента; W₁ и W₂ – ширина пиков у основания; W_0,5 – ширина пика на половине его высоты (предполагается гауссова форма пиков)

интерпретация хроматографических данных

t_i – время удерживания компонента – соответствует времени появления максимума пика на хроматограмме, где i – индекс, соответствующий i-му компоненту разделяемой смеси. При точном воспроизведении параметров хроматографической системы время удерживания является величиной, постоянной для данного вещества;

t₀ – время удерживания несорбирующегося компонента;

t_R = t_i − t₀ – приведенное (исправленное) время удерживания компонента;

R_r – относительное время удерживания компонента 2 по компоненту 1

t₁ и t₂ – времена удерживания двух компонентов, измеренные от момента инжекции.

r – относительное удерживание компонента 2 по компоненту 1

k¢ = (t_i – t₀)/t₀ – коэффициент емкости колонки по i компоненту;

W – ширина пика у основания (для пиков, описываемых гауссовым законом распределения, W = 4s, см. рис. 1.2);

W_0,5 – ширина пика на половине высоты (для пиков, описываемых гауссовым законом распределения, W_0,5 = 2,35s, см. рис. 1.2);

R – разрешение между пиками двух компонентов смеси может быть описано уравнениями:

, (1)

или

, (2)

При R ≥ 1,5 компоненты разделены полностью (до базовой линии).

Коэффициент p/v (отношение «пик – впадина»)

,

Данное соотношение используют для оценки эффективности хроматографической системы, если компоненты смеси разделяются не полностью (рис. 1.3).

N – число теоретических тарелок, определяется следующими выражениями:

, (3)

или

. (4)

Рис. 1.3. Хроматограмма не полностью разделяемых компонентов

H_p – высота меньшего пика относительно экстраполированной базовой линии;

H_v – высота низшей точки (седловины) кривой, разделяющей пики, относительно экстраполированной базовой линии

T – фактор асимметрии пика (хвостовой фактор) рассчитывают по уравнению (см. рис. 1.4):

(5)

где: W_0,05 – ширина пика на 5 % (1/20) его высоты;

f – расстояние между перпендикуляром, опущенным из вершины пика, и восходящей стороной пика на 5 % его высоты.

При T = 1 пик симметричен.

Рис. 1.4. Схема расчета фактора асимметрии пика

RSD (%) – относительное стандартное отклонение, вычисляемое по формуле:

(6)

где: – среднее результатов определений;

– результаты единичных определений;

n – число определений.

Для оценки пригодности хроматографической системы в колоночной хроматографии обычно используют следующие параметры: R; p/v; N; T; RSD, – как по отдельности, так и в различных сочетаниях.

В планарной хроматографии аналогом времени удерживания является фактор удерживания:

R_f = a/b, (7)

где: a – расстояние от точки нанесения пробы до центра пятна;

b – расстояние от линии старта до линии фронта элюента.

На экспериментально определяемые значения R_f заметно влияют условия хроматографирования. Оценкой хроматографической подвижности, менее чувствительной к влиянию отклонений в условиях проведения эксперимента, является величина R_s, представляющая собой отношение величины R_f одного вещества к величине R_f другого, принятого за стандарт. Величины R_f и R_s используют для идентификации веществ. Обычно выбор стандарта осуществляется так, чтобы значение R_s анализируемого вещества было в пределах от 0,5 до 2,0. Схема определения этих величин приведена на рис. 1.5.

Рис. 1.5. Схема определения значений R_f и R_s

– место нанесения образца на линию старта

Данные планарной хроматографии могут быть представлены в виде денситограмм.

Расчет содержания определяемого компонента

Существуют 3 основных метода расчета концентрации анализируемого компонента по хроматографическим данным.

1. Метод нормирования (метод внутренней нормализации, нормировки).

Применение данного метода основано на предположении, что на хроматограмме зарегистрированы все компоненты, входящие в состав анализируемой смеси, и что доля площади (высоты) каждого пика от суммы площадей (высот) всех пиков соответствует содержанию компонента в массовых процентах. Содержание каждого компонента в процентах может быть вычислено по формулам:

(8)

или

(8а)

где: S_i – площадь (высота) i-го пика;

– сумма площадей (высот) всех пиков на хроматограмме;

S – площадь (высота) основного пика.

Если чувствительность детектора различна по отношению к каждому из компонентов, то вводят поправочные коэффициенты k_i. Выражение (8) приобретает вид:

(9)

Поправочные коэффициенты рассчитывают относительно основного компонента анализируемой смеси или другого стандартного вещества по формуле:

(10)

где: С_i и С₀ – концентрация i-ого компонента и стандартного вещества соответственно;

S_i и S₀ – площадь (высота) пика i-ого компонента и стандартного вещества соответственно.

2. Метод внешнего стандарта. Готовят раствор стандартного образца определяемого компонента с концентрацией, близкой к предполагаемой концентрации этого компонента в испытуемой пробе. Последовательно хроматографируют стандартный, испытуемый и снова стандартный растворы (каждый не менее 3-х раз). Находят средние значения площадей пиков на хроматограммах и рассчитывают концентрацию определяемого компонента в испытуемом растворе по уравнению:

(11)

где: S и S₀ – средние значения площадей (высот) пиков на хроматограммах испытуемого и стандартного растворов соответственно;

С и С₀ – концентрации определяемого и стандартного растворов соответственно.

Для проведения анализа методом внешнего стандарта необходимо предварительно убедиться, что в используемом диапазоне концентраций площадь пика определяемого компонента линейно зависит от его концентрации.

3. Метод внутреннего стандарта. Метод внутреннего стандарта основан на том, что в анализируемую смесь вводят определенное количество стандартного вещества (внутренний стандарт). Это вещество должно быть химически инертным, отсутствовать в анализируемом образце и полностью отделяться от других компонентов смеси. время его удерживания должно быть близким к t_i определяемых компонентов, концентрация должна быть близка к концентрациям определяемых компонентов, пик симметричным.

В испытуемый и стандартный растворы вводят равные количества внутреннего стандарта, хроматографируют и определяют отношения площадей (высот) пиков определяемого компонента к площади (высоте) пика внутреннего стандарта в испытуемом и стандартном растворах.

Концентрацию определяемого компонента (Х) рассчитывают по формуле:

(12)

где: B=S/S₀ – отношение площади (высоты) пика определяемого компонента к площади (высоте) пика внутреннего стандарта в испытуемом растворе;

B₀=S/S₀ – отношение площади (высоты) пика определяемого компонента к площади (высоте) пика внутреннего стандарта в стандартном растворе;

С₀ – концентрация стандартного раствора.