Генотерапия

Новое направление в лечении наследственных болезней — так называемая генотерапия, которую многие исследователи рассматривают как фармакотерапию XXI в.

Генную терапию можно определить как набор методов лечения, основанного на переносе генетического материала в организм человека. Необходимыми условиями генной терапии наследственных болезней являются как минимум идентификация и клонирование гена соответствующего заболевания и более или менее полные представления о его патогенезе. Последние 10 лет характеризовались беспрецедентным ростом числа картированных генов у человека. Выделение генов человека сразу дает предпосылки для создания с их помощью продуктов, которые могут быть использованы как лекарственные средства. Технологию рекомбинантных ДНК уже используют в фармакологической промышленности для получения лекарственных средств на основе продуктов генов человека, в том числе гормонов (инсулин и гормон роста), факторов свертывания крови (фактор VIII, IX и тканевый активатор плазминогена), b-, y- и a-интерферона, интерлейкина-2, эритропоэтина и др.

Теоретически генотерапию можно применить для лечения самых разнообразных заболеваний человека: моногенных, мультифакториальных, в том числе онкологических, инфекционных, дегенеративных неврологических и т.д. Обязательное условие — достаточно хорошее знание патогенеза заболевания, по крайней мере тех его звеньев, которые являются, с одной стороны, геноконтролируемыми, а с другой — критически важными в процессе развития заболевания. Для моногенных заболеваний ситуация упрощается, так как генотерапия может планироваться даже в том случае, когда мы не знаем патогенез заболевания, но знаем, функция какого гена должна быть исправлена.

Принципы, используемые при генотерапии моногенных заболеваний, одинаково применимы и к генотерапии любых других заболеваний. Известно, по-видимому, не менее 4000 моногенных наследственных болезней, и их число, теперь уже медленнее, чем это было раньше, растет. Моногенные заболевания поражают все органы и системы органов, значительная их часть проявляется в виде синдромов. По типу наследования различают рецессивные заболевания, среди которых значительную часть составляют наследственные болезни обмена веществ (считается, что они являются наиболее перспективным объектом для генотерапии), доминантные заболевания, причиной которых во многих случаях служат мутации в генах структурных белков (теоретически менее удобный объект для генотерапии) и сцепленные с Х-хромосомой заболевания как рецессивные, так и доминантные. К настоящему времени картировано примерно 1500 генов наследственных болезней и по крайней мере несколько сотен генов идентифицировано, т.е. для этих генов выполнено одно из условий их использования в качестве генотерапевтического средства.

Генотерапия моногенных, как, впрочем, и других заболеваний, может быть реализована при выполнении ряда условий. Прежде всего должен быть выделен соответствующий ген с его регуляторными последовательностями. Существует два основных класса регуляторных последовательностей. Во-первых, это цис-регуляторные последовательности, т.е. расположенные в той же хромосоме, что и регулируемый ген. Цис-регуляторные последовательности могут выступать в качестве промоторов, в этом случае они располагаются непосредственно за 5'-концом от инициирующей последовательности гена. Цис-регуляторные последовательности могут действовать как энхансеры (небольшие участки ДНК, способные связываться с белками), тогда они могут быть расположены в любой ориентации и на любом расстоянии от регулируемого гена. Во-вторых, это трансрегулирующие последовательности, которые могут быть расположены в других хромосомах и действуют на оба гомологичных аллеля. Считают, то при трансгенозе соответствующий ген должен переноситься с цис-регулирующими последовательностями, а трансдействующие регуляторные белки будут поставляться клеткой-реципиентом. Сведения о требуемых для регулируемой экспрессии трансгенов цис-расположенных регуляторных элементах были почерпнуты в основном из экспериментов с трансгенными мышами. Оказалось, что в некоторых случаях для адекватной экспрессии «чужого» гена достаточно его перенести вместе с промотором, в то время как в других случаях в переносимую генетическую конструкцию для ее регулируемой экспрессии, как, например, для генов а- или b-глобина, кроме пучков соответствующих генов, необходимо вводить регуляторные области, расположенные на значительном расстоянии от самих генов.

Многие полагают, что в общем виде гены «домашнего хозяйства» не требуют очень точной регуляции для их экспрессии, в то время как генам, действующим тканеспецифически, такая регуляция необходима.

Для успешной генотерапии соответствующий изолированный ген должен быть эффективно доставлен в клетки-мишени. В настоящее время используют различные методы переноса генов, в том числе физические (прямая инъекция в ткань «голого» гена, кальцийфосфатная трансфекция, перенос с помощью липосом, электропарация и др.), перенос генов с помощью ретровирусов или других вирусных векторов, прицельную доставку генов в определенный тип клеток с использованием рецепторов этих клеток и некоторые другие методы.

Эти методы различаются по эффективности доставки генетических конструкций в клетки-реципиенты. Физические методы считаются наименее эффективными: трансфицируется небольшой процент клеток-реципиентов, лизосомы разрушают проникшую в клетку чужеродную ДНК и в результате только в отдельных клетках, подвергнутых обработке, введенные генетические конструкции оказываются встроенными в геном этих клеток. Тем не менее было показано, что даже при обычной инъекции ДНК в мышцы она способна проникать в мышечные клетки и экспрессироваться там в течение года. Вирусные векторы более эффективно переносят встроенные в них генетические конструкции в клетки-мишени, при этом ретровирусные векторы инфицируют делящиеся клетки и интегрируются случайным образом в их геном вместе со встроенными генетическими конструкциями, а аденовирусные векторы, напротив, трансфицируют неделящиеся клетки и не встраиваются в их геном. В качестве вирусных векторов для доставки генетических конструкций в клетки-мишени использовали также аденоассоциированные вирусные векторы, которые неслучайным образом встраиваются в определенный район хромосомы 19, векторы на основе вируса герпеса, вируса противооспенной вакцины и вируса человеческого иммунодефицита и др. Все вирусы, кроме аденоассоциированного вируса, когда их используют в качестве векторов, генетически модифицируются, поэтому они оказываются неспособными к самостоятельной репликации в клетке-хозяине, но сохраняют способность инфицировать эти клетки, а также избегать деградации лизосомами. Вирусные векторы обладают в большей или меньшей степени выраженным тропизмом к определенной ткани, что может быть использовано для направленной доставки генотерапевтической конструкции. Так, аденовирус тропен к эпителию дыхательных путей, вирус герпеса — к нейронам ЦНС, вирус гепатита — к клеткам печени и т.д. Вирусные векторы отличаются также по способности встраивать большие или меньшие отрезки чужеродной ДНК и по ряду других характеристик, важных в плане их применения для переноса генов человека.

Следует упомянуть также о возможности переноса и обеспечения функционирования человеческих генов в составе искусственных хромосом. Такие хромосомы могут нести большие отрезки ДНК, содержащие несколько генов со всеми регулирующими последовательностями. Примером искусственных хромосом могут служить YAC. Требуется, однако, проделать еще значительную работу, для того чтобы установить, какие центро- и теломерные участки хромосом должны быть в составе этих искусственных хромосом для успешного реплицирования в митозе.

Для направленной доставки генетической конструкции, предназначенной для генотерапии, в определенный тип клеток, помимо вирусов, используют и другие способы. Ген или его переносчик могут быть прикреплены к комплексу полилизин — асиалогликопротеин. Такой комплекс захватывается рецепторами гепатоцитов, и в результате генетическая конструкция проникает в печеночную клетку и может начать в ней функционировать.

Проблема направленной доставки соответствующего рекомбинантного гена просто решается в том случае, когда клетки определенного типа (лимфоциты, стволовые гемопоэтические клетки, фибробласты, кератиноциты или гепатоциты) извлекаются из организма, трансфицируются in vitro и после культивирования или непосредственно после трансфекции возвращаются в организм (генотерапия ex vivo).

Таким образом, к началу 90-х годов XX в. был накоплен достаточно большой экспериментальный опыт по созданию генетических конструкций, конструированию различных переносчиков для этих конструкций, трансфекции ими различных типов клеток in vitro и in vivo, чтобы можно было приступить к собственно генотерапии моногенных заболеваний. В списке моногенных наследственных заболеваний, наиболее подходящих для генотерапии, значительную часть составляют наследственные болезни обмена веществ, такие как болезнь Гоше (сфинголипидоз), синдромы Хантера и Гурлера (мукополисахаридозы), фенилкетонурия, гипераммониемия, цитруллинемия, синдром Леша—Найяна (недостаточность гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы), метахроматическая лейкодистрофия (недостаточность арилсульфатазы А), наследственные иммунодефициты, обусловленные недостаточностью аденозиндезаминазы и пуриннуклеозидфосфорилазы и др. В список также вошли такие неметаболические заболевания, как гемофилии А и В, связанные с недостаточностью VIII и IX факторов свертывания крови, семейная гиперхолестеринемия (недостаточность рецепторов липопротеинов низкой плотности), муковисцидоз (недостаточность муковисцидозного белка — регулятора трансмембранной проводимости), миодистрофия Дюшенна (недостаточность дистрофина) и некоторые другие заболевания. К этому списку за последние годы добавилось еще несколько наследственных болезней, кандидатов для генотерапии: наследственные нефриты, наследственные ретинопатии, некоторые формы тугоухости.

Начиная с 1989 г., когда был разрешен первый протокол для клинических испытаний генотерапии, было одобрено несколько сотен протоколов, которые предусматривали испытания генотерапии на нескольких тысячах больных. В абсолютном большинстве случаев реализация этих протоколов означала разные фазы клинических испытаний генотерапии онкологических и других мультифакториальных заболеваний, однако по крайней мере несколько десятков протоколов касалось клинических испытаний генотерапии при моногенных заболеваниях. Наиболее очевидный эффект, включая существенное уменьшение или даже исчезновение клинической симптоматики, достигнут при генотерапии врожденного наследственного иммунодефицита, обусловленного недостаточностью аденозиндезаминазы. При этом заболевании собственные лимфоциты больных после иммуностимуляции трансфицировали ретровирусным вектором, содержащим нормальный ген аденозиндезаминазы, после чего их возвращали в кровоток больного. Всю генотерапевтическую процедуру периодически повторяли. Уже после первых трансфузий генетически измененных лимфоцитов не только наблюдалось восстановление иммунологических и биохимических показателей у больных, но и существенно улучшалась клиническая картина. Если первые клинические испытания генотерапии недостаточности аденозиндезаминазы еще вызывали критику и не считались доказанными, то теперь практически не осталось сомнения в эффективности генотерапии этого заболевания.

В отношении других наследственных болезней добиться столь же значительных успехов в генотерапии пока не удалось, и в лучшем случае протоколы предусматривали реализацию 1-й фазы клинических испытаний, т.е. доказательства возможности переноса гена и обнаружения его эффектов на биохимическом — физиологическом уровне.

Генная терапия является относительно новым полем для исследований, которое определяет общее лечение заболеваний путем введения генов в клетки пациента для восстановления и / или введения новых клеточных функций.

В онкологии, генная терапия фокусируется на этиологии рака и разработке стратегий

лечения, чтобы исправить недостатки и / или манипулировать генами, чтобы осуществлять

устранение раковых клеток. Генотерапия рака осложняется тем, что рак не является

одним генетическим недостатом, а сочетанием генных мутаций. Чтобы генная терапия была эффективной, надо, чтобы причина заболевания, подлежащего лечению, была генетического природы и риск стимулирования онкогена должен быть минимальным.

Векторы, такие как жировые частицы (липосомы) и созданые вирусы , называемые вирусными (ретровирус и аденовирус) векторами, часто используются для доставки терапевтических генов, так как способны естественно включить себя в ДНК. Генная терапия может быть in vivo или ex vivo. Генотерапия in vivo переносит гены в тело пациента с помощью вектора (вирусы или липосомы). Совсем недавно, in vivo осуществили путем введения генов непосредственно в злокачественную опухоль.

В ex vivo условиях генная терапия включает в себя удаление клеток крови больного или

клеток костного мозга, которые затем подвергаются действию вируса, несущего желаемые гены (векторы). Вирус проникает в клетку и вставляет нужный ген в ДНК клетки. Клетки позднее возвращаются к пациенту внутривенно.

Для успешной генотерапии необходимо обойтись без соответствующего количества терапевтических генов к тканям-мишеням, не причинив существенной токсичности. Однако есть вопросы безопасности, которые должны быть рассмотрены с применением вирусов, таких как нарушение нормального гена, когда вектор вставляет себя в ДНК. Кроме того, не все биологические взаимодействия этих векторов с принимающей тканью полностью поняты.

Типы переноса генов

Зародышевая линия - вставки генов в оплодотворенные яйцеклеток или очень

ранние эмбрионы; измененные черты передаются будущим поколениям.

Улучшение - размещение генов у ребенка для повышения желаемых признаков.

Евгеника - генная инженерия общества, чтобы создать человеческие черты

желаемые внутри популяции.

Соматические клетки вставка новой генетической информации в терапевтических целях в неполовые клетки самого пациента. Дезактивированый ретровируса наиболее подходящий вектор, используемый в данном подходе. Это единственный вид терапии в настоящее время одобрен для человека. Все остальные находятся в процессе клинических испытаний.

Примеры условий переноса генов, включают стратегию, основанную на поставке

опухоли специфических токсинов, превращение пролекарства в токсины, индуцирует

иммунный ответ на антигены опухоли и нарушает кровоснабжения опухоли.

Другой пример использования генетически модифицированных онколитических вирусов, которые позволяют репликации опухолью конкретного вируса, чтобы тот инициировал лизис клеток и распределение генов по злокачественных клеткам.

Генотерапия в лечении рака.

Это гены, специально предназначенные для установки в раковые клетки чтобы сделать их более чувствительными, чем нормальные клетки к лечению химиотерапией.

Гены могут быть вставлены в раковые клетки, а затем активируются и производять яд (токсин), который убивает клетки.

Гены могут быть введены в раковые клетки, чтобы сделать их более очевидными для самозащиты организма (иммунной системы) и, таким образом, быть уничтожеными "естественно" клетками нашей иммунной системы.

Поврежденные гены могут быть заменены благодаря корректной работе.

Новые гены могут быть помещены в нормальных клетках, чтобы сделать их более устойчивыми к воздействию лечения, такие как лучевая терапия и химиотерапия. Это защищает здоровые клетки и, следовательно, можно управлять высокими дозами лечения. В настоящее время риск повреждения нормальных клеток часто ограничивает дозы, которые могут быть использованы.

В то время, генотерапия является экспериментальной и займет несколько лет, чтобы узнать, может ли это играть важную роль в лечении рака.

Генетические повреждения.

Рак - результат генетических повреждений (в основном приобретенные генетические изменения / мутации), что происходит с течением времени и приводит к дерегулированию клеточного роста и дифференциации. К раку приводят:

Потеря опухолью супрессорных клеток, которые обеспечивают естественное торможение роста клеток. Преобразование протоонкогенов в онкогены, которые ускоряют рост клеток.

Создание новых генов рака путем транслокации хромосом

Генотерапия. Потенциальные проблемы:

Неправильная вставка гена, который инициирует развитие рака или других болезней.

Избыточная экспрессия гена передачи, что приводит к перепроизводству недостающих белков или отсутствующих, вызывая заболевание.

Дезактивация ретровирусов, в результате чего в ходе потенциальной передачи, передается собственная генетическая информация в клетки хозяина.