2. Определение декстринирующей способности–амилазы

Принцип действия. При действии на крахмал –амилазы: образуется большое количество декстринов разного молекулярного веса, по–разному окрашивающихся йодом – амилодекстрины, эритродекстрины, ахродекстрины, мальтодекстрины.

Ход работы. В шесть пробирок вносят по 5 мл 2 %–ного раствора растворимого крахмала. В каждую пробирку добавляют по 1 мл буферного раствора с рН 5,6. Раствор фермента и воду вносят в количествах, указанных в таблице 2:

Растворы в пробирках хорошо перемешивают и ставят в термостат при 40 С. Глубину гидролиза крахмала контролируют по четвертой пробирке. Для этого из нее стеклянной палочкой периодически отбирают пробы на белую кафельную плитку, добавляя к ней раствор Люголя. Первый отбор пробы делают через пять минут после термостатирования. Пробирки выдерживают в термостате до тех пор, пока проба из четвертой пробирки не окрасится в красно–бурый цвет, что свидетельствует об образовании в этой пробирке эритродекстринов.

Таблица 2 – Основные параметры опыта и его результаты

№ пробирки	1	2	3	4	5	6
Количество фермента, мл	–	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
Количество воды, мл	4	3,8	3,6	3,4	3,2	3,0
Образовавшиеся декстрины

После этого в каждую пробирку добавляют по 2–3 капли раствора йода и 20 %–ного раствора соляной кислоты для остановки гидролиза крахмала. Содержимое пробирок окрашивается в различные цвета: от синего в первой пробирке с крахмалом до желтого – в последней, через фиолетовый и красно–бурый.

Анализируя окраску с йодом, в таблицу 2 следует записать, до каких декстринов прошел гидролиз крахмала в каждой пробирке в зависимости от количества фермента.

Материалы и реактивы. Солод; 0,1 н раствор HCI; 0,15 М раствор фосфата натрия (двузамещенный); 2 % – ный раствор крахмала; 0,1 М раствор фосфатного буфера, рН 5,6 (см. Приложение 1, п.3); 20 %–ный раствор НСI; раствор Люголя.

Оборудование. Термостат; холодильник; центрифуга; кафельные плитки; стеклянные палочки; пипетки на 5,10,15 мл; фарфоровые стаканы; водяная баня.

3. Влияние температуры на осахаривающую способность–амилазы

Каталитическая активность ферментов значительно зависит от температуры. При низкой температуре ( 0 С, 4 С) ферментативные реакции протекают с малой скоростью, а при замораживании могут и не происходить. Температурный оптимум многих ферментов лежит в пределах от 40 С до 50 С. При нагревании свыше 60–70 С ферменты инактивируются необратимо, меняя свое строение, что приводит к потере каталитической активности.

Работа выполняется коллективно всей группой, каждый студент получает индивидуальное задание при какой температуре проводить исследование. Опыты ставят при температуре 4 С (холодильник), 20 С (комнатная), 30 С, 40 С, 50 С, 60 С, 70 С (водяные бани или термостат).

Чтобы получить правильные результаты, необходимо строго соблюдать заданную температуру.

Принцип метода. Для определения осахаривающей способности, характеризующей активность – амилазы, проводят гидролиз растворимого крахмала исследуемым ферментным препаратом при рН 5,6 и различной температуре. Количество образовавшегося сахара мальтозы определяют методом Бертрана.

Метод Бертрана основан на способности свободной альдегидной или кетонной группы молекулы сахара взаимодействовать со щелочным раствором окисной меди (II) (реактивом Фелинга) и восстанавливать ее до оксида меди (I), выпадающего в виде осадка красного цвета.

По количеству образовавшегося оксида меди (I) судят о содержании сахара в испытуемом растворе.

Реактив Фелинга представляет собой смесь разных объемов 4 %–ной сернокис лой меди и щелочного раствора сегнетовой соли. При смешивании сернокислой меди со щелочью выпадает осадок гидрата окиси меди (II). Сегнетова соль препятствует выпадению осадка, образуя комплексное растворимое соединение.

В щелочной среде циклическая (полуацетальная) форма сахара полностью переходит в ациклическую и на месте свободного гликозидного гидроксила образуется альдегидная (у альдоз) или кетонная (у кетоз) группа.

Так, например, превращение циклической формы мальтозы в ациклическую протекает следующим образом:

Взаимодействие сахаров с реактивом Фелинга протекает по уравнению:

Количество образовавшегося осадка оксида меди (I) строго соответствует количеству сахара, находящегося в растворе, и определяется объемным методом. Для этого предварительно отмытый от избытка реактива Фелинга осадок оксида меди (I) обрабатывают раствором железоаммиачных квасцов. При этом медь (I) переходит в медь (II), а эквивалентное количество железа (III) восстанавливается до железа (II).

Сu⁺ – е  Cu⁺⁺

Fе⁺⁺⁺ + е  Fе⁺⁺

Количество восстановленного железа, эквивалентное количеству оксида меди (I), определяют титрованием раствором перманганата. Весь процесс сводится к следующим реакциям:

Сu₂О + Fе₂(SО₄)₃ + Н₂SО₄––> 2 СuSО₄ + 2 FеSО₄ + Н₂О;

10 FеSО₄+2 КМnО₄ + 8 Н₂SО₄––> 2Fе₂(SО₄)₃+ К₂SО₄ +2 МnSО₄ + 8 Н₂О

Титр перманганата устанавливают по меди, что дает возможность сразу пересчитать объем пошедшего на титрование перманганата на эквивалентное количество миллиграммов оксида меди (I).

Ход работы. В колбу вносят 10 мл 2 % –ного крахмального клейстера и 2 мл фосфатного буфера рН 5,6. Содержимое колбы доводят до заданной температуры (нагревают или охлаждают), после чего вносят 1 мл ферментной вытяжки, предварительно термостатированной при той же температуре, и замечают время. Гидролиз проводят 30 минут, в течение которых строго следят за поддержанием заданной температуры. Через 30 мин. в колбу вносят 3 мл 6 %– ного раствора сульфата меди для прекращения действия фермента, содержимое колбы охлаждают и доводят водой до 20 мл. Количество образовавшейся мальтозы определяют методом Бертрана. Для этого в коническую колбу пипеткой отбирают 10 мл полученного гидролизата, добавляют 10 мл воды и 40 мл реактива Фелинга (смесь 20 мл Фелинга 1 и 20 мл Фелинга II).

Испытуемый раствор с жидкостью Фелинга нагревают до кипения и кипятят 3 минуты. Кипение должно идти спокойно, жидкость в колбе должна оставаться синей, что указывает на избыток реактива Фелинга, а, следовательно, и на полноту окисления.

Сняв раствор с огня, дают некоторое время для осаждения оксида меди (I), затем жидкость декантируют через асбестовый фильтр в колбу Бунзена, соединенную с отсасывающим насосом. Оксид меди (I) должен остаться в колбе, но часть его может перейти на фильтр. Осадок в колбе 3–4 раза промывают небольшими порциями горячей воды, декантируя через тот же асбестовый фильтр. Осадок в колбе и на фильтре, во избежание его окисления кислородом воздуха, должен все время находиться под жидкостью.

После отмывания осадка Сu₂О от щелочи колбу Бунзена отключают от насоса, содержимое ее выливают. В чисто промытую колбу Бунзена вставляют тот же асбестовый фильтр. Промытый осадок оксида меди (I) в колбочке растворяют 15–20 мл железоаммиачных квасцов и количественно переносят на асбестовый фильтр. Для лучшего растворения осадка на фильтре верхний слой асбеста слегка разрыхляют стеклянной палочкой.

Когда осадок растворится, соединяют колбу Бунзена с насосом и отсасывают жидкость с фильтра. Колбочку, где был осадок, тщательно ополаскивают несколько раз водой, и промывные воды отсасывают в колбу Бунзена. Зеленоватый раствор в колбе Бунзена, содержащий ионы железа (II) , титруют раствором КМnО₄ до слаборозовой окраски, не исчезающей в течение одной минуты. Израсходованное на титрование количество мл 0,1 н. раствора перманганата (с учетом поправки на титр) умножают на его титр по меди (6,36 мг Си₂О) и по таблице (см. Приложение 2, таб.3) определяют количество мальтозы.

Мерой активности –амилазы служит количество разложившегося крахмала ферментом, содержащемся в 100 г исследуемого растительного материала (солода) в условиях опыта.

, (9)

где Х – активность фермента, %;

а– количество мальтозы, г;

0,95 – коэффициент пересчета мальтозы в крахмал;

н– навеска муки в испытуемой смеси, г.

Результаты записывают в таблицу 3 и строят график зависимости активности –амилазы от температуры.

Таблица 3 – Зависимость активности -амилазы от температуры

№	Температура, С, 0,1 н	Количество (мл) 0,1 н КMnO4, пошедшее на титрование	Количество меди, мг	Количество мальтозы, г	Активность -амилазы

Материалы и реактивы.Ферментная вытяжка; растворимый крахмал,2 % раствор; фосфатный буфер,0,1 М раствор; сульфат меди,6 % раствор; Фелинг I – сульфат меди,4 % раствор; Фелинг II (см. Приложение 1,п.4); железоаммиачные квасцы (см. Приложение 1,п.5); перманганат калия, 0,1 н раствор.

Оборудование.Термостат; водяные бани; стеклянный фильтр; колбы Бунзена; плоскодонные колбы на 100 мл; бюретки; стеклянные палочки.