2.4 Открытие ксантиноксидазы в молоке

Ксантиноксидаза (1.2.3.2.) относится к группе окислительно-восстановительных ферментов. Акцептором электронов служит кислород.

Ксантиноксидаза катализирует окисление гипоксантина в ксантин, а так же ксантина в мочевую кислоту:

ОН		ОН
		
C		C
// \		// \
N C N	О2 + Н2О	N C N + Н2О2
  		  
НС С СН		НО С С СН
\\ / \ /		\\ / \ /
N N		N N
		
Н		Н

гипоксантин ксантин

ОН		ОН
		
C		C
// \		// \
N C N	О2 + Н2О	N C N + Н2О
  		  
НОС С СН		НО С С СОН
\\ / \ /		\\ / \ /
N N		N N
		
Н		Н

ксантин мочевая кислота

Фермент способен окислять не только указанные пурины, но также птерины и ароматические и алифатические альдегиды. Так, например, формальдегид окисляется молекулярным кислородом при участии ксантиноксидазы с образованием муравьиной кислоты и перекиси водорода:

О О

// ксантиноксидаза //

НС + Н₂О + О₂ Н С + Н₂О₂

\ \

Н ОН

формальдегид муравьиная кислота

При определенных условиях ксантиноксидаза может передавать электроны и протоны не только кислороду воздуха, но и цитохромной системе. В условиях эксперимента ксантиноксидаза способна окислять субстрат за счет восстановления метиленовой сини и других красок, например, индиго, индофенола и др. Ксантиноксидаза содержится в молоке, печени, а так же в других тканях растительного и животного происхождения.

Оптимум действия ксантиноксидазы лежит в диапозоне рН от 5,5 до 8,5. Ксантиноксидаза является флавопротеидом, содержащим металл молибден (М₀). Флавопроиды имеют в качестве простетической группы вещества, окрашенные в желтый цвет и построенные по типу флавинмононуклеотида (ФМН) или флафинадениндинуклеотида (ФАД).

При восстановлении ФМН и ФАД превращаются в дигидроформу. В отличии от оксидаз геминовой природы (цитохром-оксидазы), катализирующих окисление субстрата молекулярным кислородом с образованием молекулы воды, при действии на субстрат оксидаз флавиновой природы конечным продуктом является перекись водорода.

Разрушение перекиси водорода осуществляется при участии геминовых ферментов каталазы и пероксидазы. Если перекись водорода не удаляется из сферы реакции, то действие флавиновых оксидаз прекращается.

Принцип метода.Если к свежему молоку, содержащему фермент ксантиноксидазу, добавить формальдегид и метиленовую синь, и смесь изолировать от доступа кислорода, то спустя некоторое время синее окрашивание исчезнет.

Реакция обусловлена восстановлением метиленовой сини в лейкоформу за счет окисления формальдегида в муравьиную кислоту и проходит благодаря каталитическому действию фермента ксантиноксидазы.

Ход работы.В три пробирки наливают по 5 мл свежего коровьего молока. Одну пробу кипятят 2-3 минуты и охлаждают. В прокипяченную пробирку и в одну из некипяченных проб добавляют по 1 мл 0,4 % раствора формальдегида, а в другую некипяченную 1мл воды. Затем во все три пробирки приливают по 1 мл 0,1 % раствора метиленового синего. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и заливают 3-4 капли вазелинового масла для предохранения жидкости от соприкосновения с кислородом воздуха. Все пробы помещают в водяную баню, нагретую до 40⁰С. Через некоторое время жидкость в некипяченной пробе, содержащей субстрат, обесцвечивается за счет образования восстановленной формы метиленового синего.

Если бесцветный раствор метиленового синего встряхнуть, то раствор вновь приобретет синий цвет.

Вследствие отсутствия активного фермента в первой прокипяченной и субстрата в одной из некипяченных проб обесцвечивание метиленового синего в них не происходит.

Материала и реактивы: молоко свежее; 0,4 % раствор формальдегида; 0,02 н. раствор метиленовой синий; вазелиновое масло.

Оборудование: водяная баня; термостат; пробирки химические.