2.1 Качественное определение активности сукцинатдегидрогеназы

Сукцинатдегидрогеназа (1.3.99.1.) катализирует окисление сукцината до фумарата. Кофактором фермента является ФАД - флавинадениндинуклеотид.

Реакция, катализируемая сукцинатдегидрогеназой, характеризуется абсолютной стереоспецифичностью элиминирования водорода, так что отщепляются исключительно атомы водорода в транс - положении. Если бы подобная специфичность не существовала, образовалась бы смесь (50:50) двух изомерных ненасыщенных дикарбоновых кислот; малеиновой (цис) и фумаровой (транс). Однако образуется только фумаровая кислота:

FАD FАDН₂

Н Н				НООС Н Н Н
 			сукцинат-	\ /  
НООС СССООН				С= С + С = С
 				/ \  
Н Н			дегидроге наза	Н СООН НООС СООН
				фумаровая к-та малеинова к-та
				(транс) (цис)
				образуется не образуется

 Цис и транс изомеры получились бы совместно,

 если реакцияидет неспецифична 

Среди ферментов цикла лимоннонной кислоты сукцинатдегидрогеназа занимает особое место, поскольку локализована в митохондриальной мембране:

		О					ОН
							
		С					С
	/	\				//		\
	СIС	ССI				СIС		ССI
								
	Н С	СН				Н С		СН
	\	/				\\		/
СООН		С			СООН			С
			сукцинатдегидро-					
СН2	+	N			СН	+		N Н
			геназа (скелетной					
СН2		С	мышцы)		СН			С
	//	\				//		\
СООН	Н С	С Н			СООН	Н С		С Н
								
	Н С	СН				Н С		СН
	\\	/				\\		/
		С						С
								
янтарная		ОNа			фумаровая			ОNа
кислота					кислота

окисленная форма восстановленная форма

(синий цвет) (бесцветная)

Принцип метода.В условиях опыта в качестве акцептора водорода при окислении сукцината используется 2,6 - дихлорфенолиндофенол, его натриевая соль.

В водном растворе окисленная форма 2,6 - дихлорфенолиндофенола окрашена в синий цвет. Восстановленная форма этого соединения - бесцветна. Активность сукцинатдегидрогеназы мышц обнаруживают, добавляя к мышечной кашице растворы янтарной кислоты и натриевой соли окисленной формы 2,6 - дихлорфенолиндофенола. Если сукцинатдегидрогеназа активна, интенсивность синей окраски ослабевается, благодаря бесцветной форме 2,6 - дихлорфенолиндофенола.

Ход работы.В две пробирки отмеривают по 3 мл фосфатного буфера с рН 7,4. В одну пробирку(опытную) добавляют 5 капель 5 %- ного раствора янтарной кислоты и (для нейтрализации) 5 капель 0,1 н. раствора едкого натра, в другую (контрольную) приливают 10 капель дистиллированной воды. В обе пробирки добавляют по 1 мл 0,001 н. раствора 2,6 - дихлорфенолиндофенола и по 50 мг хорошо измельченной мышечной ткани (свежей). Обе пробирки помещают на 20 мин. в термостат при 37⁰С. Сравнивают интенсивность окрашивания в контрольной и опытной пробирках. Делают выводы и оформляют таблицу 2.

Таблица 2 - Основные параметры опыта и его результаты

№ опыта	Субстрат	Фермент	Тип катализируемой реакции	Условия проведения опыта (toС, рН, добавление др. реагентов)	Наблюдения

Материалы и реактивы: экстракт мышечной ткани (см. Приложение В, п.3); фосфатный буфер, рН 7,4 (см. Приложение В, п.4); 5 % - ный раствор янтарной кислоты; 0,1 н. раствор NаОН; 0,001 н. раствор 2,6 - дихлорфенолиндофенола.

Оборудование:пробирки; пипетки; термостат.