4.3 Обнаружение действия фенолоксидазы (качественно)
Фенолоксидаза катализирует окисление полифенолов с участием кислорода воздуха как акцептора водорода.
Источником фенолоксидазы служит картофель, гваяковая смола содержит субстрат полифенолпирокатехин. При действии фенолоксидазы на пирокатехин получается продукт окисления о - бензохинон, окрашенный в синий цвет. Реакция идет по следующей схеме:
|
Н |
|
|
|
Н |
|
С // \ |
|
|
|
С // \ |
|
Н С С ОН + 1/2 О2 |
фенолоксидаза > |
Н С С = О + Н2О | ||
|
Н С С ОН \\ / С |
|
Н С С = О \\ / С | ||
|
Н |
|
|
|
Н |
|
пирокатехин (бесцветный) о - бензохинон (синий) | ||||
|
| ||||
Ход работы. На разрезы сырого и вареного картофеля наносят по 1-2 капли 1 % - ного спиртового раствора гваяковой смолы (0,02 М раствора пирокатехина) и отмечают появление окраски на одном из срезов картофеля. Отмечают разницу в окраске на срезах. Результаты опытов оформляют в виде таблицы 5 и делают выводы.
Таблица 5Основные параметры опыта и его результаты
|
№ опыта |
Субстрат |
Фермент |
Тип кализиру- емой реакции |
Условия проведения опыта (toС, рН, добавление др. реагентов) |
Наблюде-ния |
|
|
|
|
|
|
|
Материалы и реактивы: картофель сырой и варенный; 1 % - ный раствор гваяковой смолы в этаноле или 0,02 М раствор пироктехина.
Оборудование капельницы.
4.4 Определение активности о - дифенолоксидазы (полифенолоксидазы) и пероксидазы по Михлину и Броневицкой
Принцип метода определения активностио–дифенолоксидазы и пероксидазы основан на вторичном окислении аскорбиновой кислоты хинонами, образующимися из пирокатехина под действием ферментов. Избыток неокисленной кислоты оттитровывают йодом:
|
Н |
|
|
|
Н |
| |||||||||
|
С // \ |
|
|
|
С // \ |
| |||||||||
|
Н С С ОН + 1/2 О 2 |
полифенолоксидаза > |
Н С С = О + Н2О |
| |||||||||||
|
Н С С ОН \\ / С |
|
Н С С = О \\ / С |
| |||||||||||
|
Н |
|
|
|
Н |
| |||||||||
|
пирокатехин |
|
|
|
о-хинон |
| |||||||||
|
|
Н |
|
Н |
|
О= С | |||||||||
|
|
|
|
|
|
| |||||||||
|
НОС |
С |
|
С |
|
О = С | |||||||||
|
|
// \ |
|
// \ |
|
О | |||||||||
|
|
Н С С = О |
|
Н С С ОН |
|
О = С | |||||||||
|
|
|
|
|
+ |
| |||||||||
|
НС |
Н С С = О |
|
Н С С ОН |
|
Н С | |||||||||
|
|
\\ / |
|
\\ / |
|
| |||||||||
|
НОСН |
С |
|
С |
|
НОСН | |||||||||
|
|
|
|
|
|
| |||||||||
|
СН2ОН |
Н |
|
Н |
|
СН2ОН | |||||||||
|
аскорбиновая о - хинон пирокатехин дегидроаскорбиновая кислота кислота | ||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
| |||||||||
|
|
|
|
|
|
| |||||||||
|
|
|
|
|
О= С |
| |||||||||
|
|
|
|
|
|
| |||||||||
|
НОС |
|
|
|
НОС J |
| |||||||||
|
|
|
|
|
О |
| |||||||||
|
|
J2 |
|
|
НОС J |
| |||||||||
|
|
|
|
|
|
| |||||||||
|
НС |
|
|
|
НС |
| |||||||||
|
|
|
|
|
|
| |||||||||
|
НОСН |
|
|
|
НОСН |
| |||||||||
|
|
|
|
|
|
| |||||||||
|
СН2ОН |
|
|
|
СН2ОН |
| |||||||||
|
неокисленная дииод- аскорбиновая кислота аскорбиновая кислота |
| |||||||||||||
О= С 
О
НОС
+
О=С 
О
НОС
+
Ход работы.Получение ферментной вытяжки.
3 г. испытуемого материала растирают в ступке с 20 мл 0,3 М ацетатного буфера с рН 4,7, переносят в колбу и оставляют на 30 минут для настаивания при комнатной температуре. После настаивания вытяжку центрифугируют.
Определение активности о–дифенолоксидазы (Е0). К 1 мл центрифугата (ферментная вытяжка) добавляют 3 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,1 %–ного раствора аскорбиновой кислоты и 1 мл 0,02 М раствора пирокатехина. Смесь встряхивают 2 минуты, добавляют 1 мл 10 %–ного раствора фосфорной кислоты и титруют из микробюретки 0,01 н раствором йода в присутствии нескольких капель крахмала. Параллельно проводят контрольное определение с прокипяченной вытяжкой (1 мл вытяжки и 3 мл дистиллированной воды кипятят 1 минуту, затем добавляют 1 мл воды взамен испарившейся при кипячении, и все необходимые реактивы, как и в случае с опытной пробой).
Активность выражают в мл 0,01 н раствора йода на 1 г испытуемого материала по разности контрольной и опытной пробы.
Определение суммарной активности о–дифенолоксидазы и пероксидазы в присутствии перекиси водорода (Ео+n).
К 1 мл центрифугата добавляют 3 мл дистиллированной воды,1 мл 0,4%–ного раствора перекиси водорода, 2 мл 0,1%–ного раствора аскорбиновой кислоты и 1 мл 0,02 М раствора пирокатехина. (Все растворы и вода должны иметь температуру 18–20 С). Смесь встряхивают 2 минуты, добавляют 1 мл 10%–ного раствора фосфорной кислоты и титруют из микробюретки 0,01 н раствором йода в присутствии крахмала.
Активность пероксидазы (Еn) определяют по разности суммарной активности о–дифенолоксидазы и пероксидазы и активности одной о–дифенолоксидазы:
Еn= Еo+n– Еo
Результаты записывают в таблицу 6.
Таблица 6 - Основные параметры опыта и его результаты
|
Материал |
Ферменты | ||||||||
|
|
о-дифенолоксидаза и пероксидаза |
о-дифенолоксидаза |
пероксидаза | ||||||
|
|
Vo |
Vk |
Vk-Vo |
Ео+п (Vk-Vo)20 n |
Vo |
Vk |
Vk-Vo |
Ео (Vk-Vo)20 n |
Еn= Еo+n– Еo |
|
|
|
|
| ||||||
Где: Vo– объем, пошедший на титрование опытной пробы, мл 0,01 н I2;
Vk – объем, пошедший на титрование контрольной пробы, мл 0,01 н I2;
Vk-Vo – разность показаний титрования контрольной и опытной пробы, мл 0,01 н I2;
Еo+n – активность о–дифенолоксидазы и пероксидазы мл 0,01 н. I2/г;
Еo – активность о–дифенолоксидазы, мл 0,01 н. I2/г;
Еn – активность пероксидазы, мл 0,01 н. I2/ г;
n– навеска, г.
Материалы и реактивы:картофель, солод, мука, капуста, хрен, яблоки; 0,3 М раствор ацетатного буфера рН = 4,7 (см. Приложение В, п.12); 0,1 %–ный раствор аскорбиновой кислоты; 0,02 М раствор пирокатехина; 0,4 %–ный раствор пероксида водорода; 10 %–ный раствор ортофосфорной кислоты; 0,01 н. раствор йода; крахмал, индикаторный раствор (см. Приложение В, п.13).
Оборудование:ступки; пипетки на 20 мл; колбы на 50 мл; микробюретки; центрифуга.