Министерство образования Республики Беларусь

МОГИЛЕВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

КАФЕДРА ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Ферменты оксидоредуктазы

Методические указания к лабораторному практикуму

по дисциплине ”Биохимия"

для студентов специальностей Т.18.01., Т.18.02., Т.18.03.

Часть II. “Витамины и ферменты”

Могилев 2001

УДК 557.1

Рассмотрены и утверждены

на заседании кафедры ХТВМС

протокол № 10 от 18 мая 20001г.

Составители: доц. О.Н.Макасеева

асс. Л.М.Ткаченко

Рецензенты: проф. Г.Н. Роганов

доц. В.Н. Тимофеева

© Могилевский государственный технологический институт

Содержание

С

Введение.........................................................................................................4

1 НАД⁺- зависимые дегидрогеназы................................................................5

1.1 Использование неорганического фосфата в процессе брожения......6

1.2 Определение специфичности лактатдегидрогеназы............................8

2Флавиновые дегидрогеназы.........................................................................9

2.1 Качественное определение активности сукцинатдегидрогеназы....10

2.2Глюкозооксидаза (1.1.3.4)....................................................................12

2.3 Определение глюкозы с использованием фермента

глюкозоксиды..........................................................................................13

2.4 Открытие ксантиноксидазы в молоке.................................................14

3 Гемсодержащие ферменты - гемопротеины..........................................16 3.1Каталаза (1.11.1.6).................................................................................17

3.1.1 Обнаружение действие каталазы (качественно).............................17

3.1.2 Определение активности каталазы по А. Н. Баху и А.И.Опарину..............................................................................................18

3.2Пероксидаза (1.11.1.7)..........................................................................18

3.2.1 Обнаружение действия пероксидазы (качественно)......................19

3.2.2 Определение активности пероксидазы............................................20

4 Медь - содержащие оксидазы....................................................................21

4.1 Определение активности аскорбатоксидазы.....................................21

4.2 Полифенолоксидаза (1.14.18.1)...........................................................23

4.3 Обнаружение действия фенолоксидазы (качественно).....................24

4.4 Определение активности о–дифенолоксидазы (полифенолоксидазы) и пероксидазы по Михлину и Броневицкой…..25

5 Список используемых источников...........................................................27

Приложение А...............................................................................................29

Приложение В............................................................................................30

Введение

К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие окислительно–восстановительные реакции. Общая схема их может быть представлена следующим образом:

оксидоредуктаза

Субстрат + Акцептор _{} Субстрат + Акцептор

АН₂В^{}А ВН₂

Характерной особенностью деятельности оксидоредуктаз в живой клетке является их способность образовывать системы ( так называемые цепи окислительно–восстановительных ферментов), в которых осуществляется многоступенчатый перенос атомов водорода или электронов от первичного субстрата к конечному акцептору, которым является, как правило, кислород, так что в результате образуется вода.

Другая особенность оксидоредуктаз состоит в том, что, будучи двухкомпонентными ферментами с весьма ограниченным набором активных групп (коферментов), они способны ускорять большое число самых разнообразных окислительно–восстановительных реакций. Это достигается за счет того, что один и тот же кофермент способен соединяться со многими апоферментами (белками), образуя каждый раз оксидоредуктазу, специфическую по отношению к тому или иному субстрату или акцептору.

Еще одна, пожалуй, главная особенность оксидоредуктаз заключается в том, что они ускоряют протекание химических процессов, связанных с высвобождением энергии. Последняя используется как для обеспечения синтетических процессов в организме, так и для других нужд.

Оксидоредуктазы, которые переносят атомы водорода или электроны непосредственно на кислородные атомы, носят название аэробных дегидрогеназ или оксидаз. В отличии от них оксидоредуктазы, переносящие атомы Н или электроны от одного компонента окислительной цепи ферментов к другому без передачи их на кислородные атомы, называют анаэробными дегидрогеназами или редуктазами.

Подклассы оксидоредуктаз определяются типами соединений, выступающих в качестве доноров электронов. Например, ферменты подкласса 1 катализируют окисление гидроксигрупп до карбонильных, подкласса 2 - окисление карбонильных до карбоксильных и т.д.

В отдельные подклассы выделены ферменты ( оксигеназы), катализирующие реакции введения атомов кислорода - одного, подкласс 14 (монооксигеназы) - двух, подкласс 13 (диоксигеназы) из молекулы О_2.

В данном методическом указании рассмотрены более подробно строение и механизм действия оксидоредуктаз, имеющих важное значение в процессах технологической переработки пищевого сырья и при его хранении. Не менее важна роль этих ферментов в процессах дыхания живых организмов, окисления органических соединений - углеводов, липидов, белков, снабжающих клетку энергией.

1 НАД⁺- зависимые дегидрогеназы

Ферменты, катализирующие реакции окисления-восстановления с участием никотинамидадениндинуклеотида (НАД⁺), или его близкого аналога - никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ⁺).

Более половины известных в настоящее время оксидоредуктаз содержат НАД⁺ или НАДФ⁺ в качестве кофермента, т.е являются двухкомпонентными, их называют пиридинпротеином. Пиридинпротеины способны отнимать от субстратов (спирты, альдегиды, кетокислоты, амины и др.) и включать в молекулу НАД⁺ (НАДФ⁺) 2 электрона и один протон ( гидрид ион Н^-) (окисляя, таким образом, указанные соединения, а второй протон остается в среде, в результате чего утрачивается положительный заряд пиридинового цикла НАД⁺ (НАДФ⁺):

Н		Н Н
		\ /
С O		С O
// \ //		/ \ //
Н С C С- NH2		Н С C С- NH2
  		   
Н- С C- Н		Н- С C- Н
О \\ + /		О \ /
 N		 N
НО-Р- О-СН2 О		НО-Р- О-СН2 О
NН2 +2Н		 NН2
Н Н 		 Н Н 
О Н   Н N C [ 2Н+,2е;	Н-, Н+]	О Н   Н N C
 НО НО  \ / \\		 НО НО  \ / \\
НО-Р= О Н-C C N		НО-Р= О Н- C C N
   		   
О- СН2 О NC CН		О - СН2 О NC CН
\ //		 \ //
 Н Н N		 Н Н N
Н   Н Н3РО4		Н   Н Н3РО4
НО О( Н)		НО О(Н)

НАД⁺ (НАДФ⁺ ) НАДН (НАДФН)

Все пиридинпротеины являются анаэробными дегидрогеназами, т.е не передают снятые с субстрата атомы водорода на кислород, а передают их на ближайший в окислительной цепи другой фермент, как правило, флавопротеид.

Кофермент НАДФ⁺ является производным НАД⁺, у которого водород ОН - группы 2-го углеродного атома рибозы аденозина замещен на остаток фосфорной кислоты. Механизм окисления (своих субстратов) при участии НАДФ⁺в качестве кофермента аналогичен таковому при посредстве НАД⁺.

Несмотря на то, что реакции, катализируемые НАД⁺ и НАДФ⁺ зависимыми ферментами - дегидрогеназами обратимы, их биологическое значение в большинстве случаев связано, преимущественно, с протеканием реакции в определенном направлении. При этом отчетливо проявляется такая закономерность: если биологически значимо окисление субстрата, то в реакции в качестве окислителя чаще всего участвуют НАД⁺ . Если же реакция этого подкласса имеет значение для восстановления какого - либо органического соединения, то чаще всего восстановителем является НАДФН.