Приготовление витальных препаратов микроорганизмов
Препарат типа «раздавленная капля». Этот препарат готовят для рассматривания микроорганизмов в живом состоянии. Для этого на середину предметного стекла наносят каплю водопроводной воды и в нее вносят небольшое количество исследуемых микроорганизмов (или каплю, суспензии микроорганизмов), размешивают и покрывают покровным стеклом. Культуру, выращенную на плотной питательной среде, переносят в каплю воды бактериологической петлей (рис.2); культуру, выращенную в жидкой среде, - стерильной пипеткой. Капля исследуемого материала должна быть
настолько мала, чтобы после прижимания ее покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под него. В противном случае избыток жидкости необходимо удалять фильтровальной бумагой, которую затем сразу же опускают в дезинфицирующий раствор.
Препарат «висячая капля». Такой препарат используют для исследования подвижности микроорганизмов, прорастания спор и т.д. Для этого каплю суспензии микроорганизмов петлей наносят на покровное стекло, края которого предварительно смазывают вазелином, затем поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с лункой в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки (рис.3).
Препараты живых клеток рассматривают с «сухими системами» микроскопа. Препараты, работа с которыми закончена, прежде чем вымыть, выдерживают в дезинфицирующем растворе.
Рис.3. Препарат «висячая капля»
Рис.2 Бактериологическая
петля (1) и препаровальная
игла (2)
Препараты фиксированных окрашенных клеток
Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание фиксацию и окраску. Способы окрашивания делят на простые и сложные. Различные способы окраски основаны на физико-химических особенностях микробной клетки и взаимодействии структур и веществ ее с используемыми реактивами.
При простых способах окрашивания используют один краситель. Простое окрашивание применяется для ознакомления с морфологией бактерий.
Приготовление мазка. На обезжиренное предметное стекло наносят маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала. Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1-2см3 возможно более тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы высыхал почти тотчас же после приготовления.
Высушивание мазка. Полученный мазок высушивают при комнатной температуре на воздухе или (для ускорения) в потоке теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх (не допуская нагрева стекла).
Фиксация. Цели фиксации: убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске. Стекло с сухим мазком трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх.
Окраска. Охлажденный фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки, лежащие над кюветой (рис.4), наносят 1…2 капли фуксина и, после выдерживания в течение 1…3 мин, смывают с него краску слабой струей воды из промывалки до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают, вначале осторожно промокая
фильтровальной бумагой, а затем –
на воздухе до полного его высыхания.
На препарат наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют с объек-
тивом 100х.
Рис.4 Кювета с параллельными рейками для окрашивания
препарата
При сложных способах окрашивания применяют два или более красящих вещества. Кроме красящих, используют различные обесцвечива-ющие вещества (спирт и др.). Такие способы окрашивания называют диф-ференциальными. Дифференциальныая окраска предполагает окрашивание определенных структур клетки. С ее помощью выявляют некоторые клеточ-ные структуры, запасные вещества и включения.