§2.2.Определение линейности
Линейность методики – это наличие прямой пропорциональной зависимости оптической плотности от концентрации или количества определяемого вещества в анализируемой пробе.
Линейность выражается уравнением у = ax + b. Это уравнение называют линейной регрессией. Параметр bградуировочной функции характеризует отрезок, отсекаемый на оси ординат и соответствующий значению холостого опыта, а коэффициент a характеризует наклон градуировочной кривой и является отражением чувствительности методики
Для проверки линейности следует брать не менее 5 экспериментальных точек. При этом наиболее правильно использовать отдельные навески и затем готовить из них растворы соответствующих концентраций.
На характер градуировочного графика и на линейность в значительной степени могут оказывать влияние условия выполнения анализа: количество реактивов, концентрации анализируемых растворов и др.
Таблица 1. Зависимость оптический плотности от концентрации.
|
Концентрация полученного раствора, % |
0.0004 |
0.0012 |
0.002 |
0.0028 |
0.0036 |
|
Оптическая плотность |
0.108 |
0.218 |
0.331 |
0.443 |
0.543 |
Полученные данные следует представлять в виде градуировочного графика с линией тренда, уравнения графика и величины коэффициента корреляции.
Основной характеристикой линейности является коэффициент корреляции, мера взаимосвязи изменяемых явлений (взаимосвязь).
Коэффициент корреляции составил 0,999772
Формулы и расчеты коэффициентов градуированного графика:
Таблица 2.Результаты определения оптической плотности и концентрации. Расчёты.
|
Хi |
уi |
xi×уi |
Х² |
У² |
|
0,0004 |
0,108 |
0,000043 |
0,00000016 |
0,0116 |
|
0,0012 |
0,218 |
0,00023 |
0,00000144 |
0,0475 |
|
0,002 |
0,331 |
0,00066 |
0,000004 |
0,1095 |
|
0,0028 |
0,443 |
0,00124 |
0,0000078 |
0,19624 |
|
0,0036 |
0,543 |
0,00195 |
0,000001296 |
0,294484 |
|
∑=0,01 |
∑=1,553 |
∑=0,004123 |
∑=0,000014696 |
∑=0,659324 |
x- концентрация;y – аналитический сигнал ( оптическая плотность);
Заключение.
Для аналитических целей можно использовать только ту методику для которой зависимость функций от аргумента коррелируется с коэффициентом r,который должен быть ≥0,99.
Таким образом, полученные результаты находятся в пределах допустимых отклонений, т.к. валидация по показателю линейность может варьировать в незначительных пределах.
§2.3.Определение прецизионности
Прецизионность — степень близости друг к другу независимых результатов измерений, полученных в конкретных установленных условиях. По существу это мера суммы случайных ошибок.
Прецизионность зависит только от случайных факторов и не связана с истинным значением или принятым опорным значением. Эта характеристика зависит только от случайных факторов и не связана с истинным или условно истинным значением измеряемой величины. Мера прецизионности обычно вычисляется как стандартное (среднеквадратическое) отклонение результатов измерений, выполненных в определенных условиях. Количественные значения мер прецизионности существенно зависят от заданных условий. При установлении прецизионности следует иметь в виду, что данная характеристика бывает трех уровней:
- повторяемость (сходимость);
-промежуточная прецизионность (внутрилабораторнаявоспроизводимость);
- межлабораторная воспроизводимость.
Однако, для целей фармацевтического анализа бывает достаточно только первого уровня.
При установлении повторяемости существует два способа её оценки.
1. Не менее девяти определений, охватывающих диапазон применения методики (например, три концентрации / три определения для каждой);
2. Не менее шести определений для образцов с содержанием анализируемого вещества, близким к номинальному.
Для определения прецизионности необходимо приготовить моделбную смесь. Затем из неё готовят по три параллельных раствора:
Растворы А1, А2, А3 в три мерные колбы вместимостью 100мл помещают по 3 мл раствора модельной смеси и доводят водой до метки.
Растворы А4, А5, А6 в другие три мерные колбы вместимостью 100мл по 5 мл раствора модельной смеси и доводят водой до метки.
Растворы А7, А8, А9 в следующие три мерные колбы вместимостью 100 мл помещают 7 мл раствора модельной смеси и доводят водой до метки.
Измеряют оптическую плотность каждого из 9 приготовленных растворов на спектрофотометре при длине волны 445 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО рибофлавина. Расчёт содержания рибофлавина в г/мл проводят по формуле:
где,
Ах- оптическая плотность исследуемого раствора
Ао- оптическая плотность раствора СО рибофлавина
0,00001- содержание рибофлавина в г в 1 мл раствора СО
Va- объем аликвоты раствора модельной смеси 2, взятый для разведения, мл.
X1
=0.0205%
X2=
=0.0194%
X3=
=0.0185%
X4=
=0.020%
X5=
=0.0210%
X6
=
=0.0195%
X7=
=0.0239%
X8=
=0.024%
X9=
=0.0248%
Ccт =0,00102%
Далее вычисляют величину стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD). Следует отметить, что ни один нормативный документ не устанавливает нижнюю границу прецизионности и она определяется используемым методом анализа:
В таблицу 3 заносятся все полученные , в ходе проведения анализа, данные.
Таблица 3 – Результаты определения прецизионности методики определения рибофлавна в растворе
|
№п/п |
Хi |
Хi-Хср |
(Хi-Хср)2 |
SD |
RSD,% |
|
1 |
0,0205 |
-0,000788889 |
6,22346E-07 |
0,002329401 |
10,94186484 |
|
2 |
0,0194 |
-0,001888889 |
3,5679E-06 |
|
|
|
3 |
0,0185 |
-0,002788889 |
7,7779E-06 |
|
|
|
4 |
0,02 |
-0,001288889 |
1,66123E-06 |
|
|
|
5 |
0,021 |
-0,000288889 |
8,34568E-08 |
|
|
|
6 |
0,0195 |
-0,001788889 |
3,20012E-06 |
|
|
|
7 |
0,0239 |
0,002611111 |
6,8179E-06 |
|
|
|
8 |
0,024 |
0,002711111 |
7,35012E-06 |
|
|
|
9 |
0,0248 |
0,003511111 |
1,23279E-05 |
|
|
|
Хср |
0,021288889 |
Σ(Хi-Хср)2 |
4,34089E-05 |
|
|
В фармацевтическом анализе для нормирования значений прецизионности наиболее оптимальным можно считать рекомендации американской ассоциации аналитической химии, в которой приводится данные оценки сходимости (воспроизводимости), как функции аналитической концентраций, которые приведены в таблице 4.
Таблица 4.Данные оценки воспроизводимости.
|
Содержание анализируемого компонента в образце, % |
Относительное стандартное отклонение (RSD) |
|
100 |
1,3 |
|
10 |
2,8 |
|
1 |
2,7 |
|
0,1 |
3,7 |
|
0,01 |
5,3 |
|
0,001 |
7,3 |
|
0,0001 |
11,0 |
|
0,00001 |
15,0 |
|
0,000001 |
21,0 |
|
0,0000001 |
30,0 |
Заключение: Так как рассчитанное значение RSD не больше приведённого в таблице, методика соответствует требованиям валидации по показателю прецизионность.
Примечания:
Прецизионность зависит только от случайных погрешностей и не имеет отношения к истинному или установленному значению измеряемой величины.
Меру прецизионности обычно выражают в терминах неточности и вычисляют как стандартное отклонение результатов измерений. Меньшая прецизионность соответствует большему стандартному отклонению.
«Независимые результаты измерений (или испытаний)» - результаты, полученные способом, на который не оказывает влияния никакой предшествующий результат, полученный при испытаниях того же самого или подобного объекта. Количественные значения мер прецизионности существенно зависят от регламентированных условий. Крайними случаями совокупностей таких условий являются условия повторяемости и условия воспроизводимости.