Проведение анализа

Добавить в пробу:	Холостая проба	Калибровочная проба	Опытная проба
1. Калибратор	--	10 мкл	--
2. Сыворотка	--	--	10 мкл
3. Реагент	1 мл	1 мл	1 мл

Перемешать тщательно содержимое пробирок и инкубировать при температуре 37С в течение 5 минут или при комнатной температуре (18-25С) – в течение 15 минут. Измерить оптическую плотность опытной (D_оп) и калибровочной (D_калиб) проб против холостой пробы при длине волны 540 нм. Окраска раствора стабильна в течение 30 минут.

Расчет

Содержание триацилглицеролов в сыворотке рассчитывают по стандарту (калибратор) по формуле:

Аоп С (ммоль/л) = ------------  Скалиб, Акалиб

где С – концентрация триацилглицеролов в анализируемой пробе, ммоль/л;

А_оп – оптическая плотность опытной пробы;

А

_калиб – оптическая плотность калибровочной пробы;

С_калиб – концентрация триацилглицеролов в калибраторе, ммоль/л.

При содержании триацилглицеролов в пробе свыше 11,4 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Клинико-диагностическое значение: ТАГ определяют для типирования эссенциальных гиперлипопротеинемий. Например, гиперлипопротеинемия типа  отличается высоким уровнем холестерина в сыворотке по сравнению с типом , для которой характерно высокие уровни холестерина и ТАГ.

Повышение уровня ТАГ в сыворотке бывает и при других заболеваниях (переломы костей, нефротический синдром, гипотиреоз, алкоголизм), но диагностического значения в этих случаях не имеет.

Иногда, при несвоевременном заборе биоматериала, можно обнаружить алиментарную гипертриглицеридемию, характеризующуюся высокими концентрациями ТАГ после приема жирной пищи.

Лабораторная работа № 9.

Определение концентрации общего холестерола в сыворотке крови ферментативным методом

Принцип метода: Эфиры холестерола под действием фермента холестеролэстеразы распадаются на холестерол и жирные кислоты. Холестерол окисляется холестеролоксидазой с образованием перекиси водорода. Пероксид водорода реагирует с хромогеном с образованием окрашенного вещества (хинонимин):

Эстераза Эфиры холестерола ----------------> Холестерол + Жирные кислоты

Оксидаза Холестерол + О2 ----------------> Холест-4-ен-3-он + Н2О2

Пероксидаза 2Н2О2 + ГБА + 4-Амноантипирин ------------------------> Хинонимин + 4Н2О

Интенсивность окраски раствора при длине волны 550 нм прямо пропорциональна концентрации холестерола в нем.

Линейность метода: до 19,4 ммоль/л.

Норма:

Сыворотка крови –  5,2 ммоль/л (37С).

Оборудование и реагенты:

1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 550 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37С;

2. Секундомер;

3. Автоматические пипетки на 10 мкл и 1000 мкл;

4. Сыворотка крови;

5. Реагент (холестеролэстераза, холестеролоксидаза  50 Е/л, пероксидаза  1000 Е/л, 4-аминоантипирин 0,3 ммоль/л);

6. Стандарт (Холестерол 5,2 ммоль/л);

7. Дистиллированная вода.