Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Образец (например, сыворотка)	50 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	50 мкл
3. Дистиллирован-ная вода	--	50 мкл	--
4. Реагент 1.	1 мл	1 мл	1 мл
Перемешать содержимое пробирок
5. Реагент 2	250 мкл	250 мкл	250 мкл

Перемешать содержимое пробирки и включить секундомер. Точно через 60 секунд измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 490-510 нм (А₁). Повторить измерение через 60 секунд (А₂). Рассчитать изменение оптической плотности за минуту для опытной и стандартной проб:

А_оп = А_2оп – А_1оп;

А_ст = А_2ст – А_1ст.

Расчет

Расчет по стандарту концентрации креатинина в сыворотке (плазме) проводят по формуле:

Аоп С (мкмоль/л) = -----------  Сст, Аст

где А_{оп / ст} – изменение оптической плотности в минуту;

С_ст – концентрация стандарта.

Расчет по стандарту концентрации креатинина в суточной моче проводят по формуле:

Аоп С (ммоль/л) = -----------  Сст  50, Аст

где А_{оп / ст} – изменение оптической плотности в минуту;

С_ст – концентрация стандарта;

50 – коэффициент разведения.

Если концентрация креатинина превышает 1,33 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Нельзя анализировать иктеричные образцы, так как билирубин искажает результаты измерений.

Клинико-диагностическое значение: Определение концентрации креатинина проводят для исследования функции почек. При значительном ухудшении функции почек концентрация креатинина в сыворотке увеличивается.

У здоровых людей концентрация креатинина в сыворотке относительно постоянна и мало зависит от пола, возраста, диеты, так как образование креатинина в мышцах как конечного продукта метаболизма относительно постоянно.

Клиренс эндогенного креатинина используют в качестве меры клубочковой фильтрации.

Тема 8. Обмен сложных белков

Лабораторная работа № 15.

Определение концентрации мочевой кислоты в биологических жидкостях ферментативным методом

Принцип метода: Мочевая кислота под действием фермента уриказы окисляется до алантоина с образованием перекиси водорода. Пероксид водорода реагирует с хромогеном (4-аминоантипирин с N-этил-N-(гидрокси-3-сульфопропил)-m-толуидином [TOOS]) с образованием сине-фиолетового красителя:

Уриказа Мочевая кислота + Н2О + О2 ----------------> Алантоин + СО2 = Н2О2

Пероксидаза 2Н2О2 + ТООS + 4-Амноантипирин ------------------------> Индамин + 3Н2О

Интенсивность окраски раствора при длине волны 550 нм прямо пропорциональна концентрации мочевой кислоты в нем.

Линейность метода: 65,7 -1190 мкмоль/л.

Норма:

Сыворотка крови – мужчины – 214-488 мкмоль/л (25-37С);

женщины – 137-363 мкмоль/л (25-37С).

Концентрация мочевой кислоты сохраняется стабильной в сыворотке/ плазме в течение 3 дней при комнатной температуре, при температуре хранения 2-8С – в течение 7 дней, при температуре –20С – в течение 6 месяцев.

Стабильность концентрации мочевой кислоты в моче – 4 дня при комнатной температуре.

Оборудование и реагенты:

1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 550 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 25-37С;

2. Секундомер;

3. Автоматические пипетки на 20 мкл, 250 мкл и 1000 мкл;

4. Сыворотка крови/ гепаринизированная или ЭДТА- плазма / моча. Мочу предварительно развести дистиллированной водой в соотношении 1:10;

5. Реагент 1 (ТООS 1 ммоль/л в фосфатном буфере, рН 7,0 100 ммоль/л);

6. Реагент 2 (уриказа  50 Е/л, пероксидаза  1000 Е/л, 4-аминоантипирин 0,3 ммоль/л в фосфатном буфере, рН 7,0 100 ммоль/л);

7. Стандарт (раствор мочевой кислоты 357 мкмоль/л);

8. Дистиллированная вода.