Экспрессия генов Патрушев

781

Рис. II.36. Примеры исключения и доказательства отцовства с помощью ДНК-типирования

Результаты гибридизации по Саузерну с зондом F10 показывают полную идентичность фрагментов ДНК у ребенка и отца (дорожки 2 и 3), что рассматривается как доказательство отцовства, либо выявляют, по крайней мере, 6 дополнительных фрагментов ДНК у ребенка, обозначенных стрелками, которые отсутствуют у отца (дорожки 5 и 6 – исключение отцовства)

На рис. II.36 показаны результаты одного из таких опытов. Интерпретация ДНК-фингерпринтов, полученных при анализе множественных локусов, основана на трех постулатах. Прежде всего, предполагается, что фрагменты ДНК, видимые на фингерпринтах, являются аллельными продуктами отдельных генетических локусов человека и передаются потомству независимо друг от друга. Во-вторых, считается, что для каждого генетического локуса частоты встречаемости в популяции отдельных аллелей следуют нормальному распределению Пуассона. И, наконец, принимается, что фрагменты ДНК, электрофоретическая подвижность которых совпадает, представляют один и тот же аллель конкретного локуса. Накопленный опыт работы с ДНК-фингерпринтами показывает, что первое допущение соблюдается достаточно хорошо: аллелизм (парность гомологичных генов, определяющих разные фенотипические признаки у диплоидных организмов) и генетическое сцепление между исследуемыми локусами наблюдаются редко. Невыполнение второго предположения не сказывается серьезно на результатах тестирования, поскольку выводы делаются без учета частоты встречаемости отдельного аллеля на основе совпадения структуры (фрагментов ДНК) многих локусов. Третий постулат является более спорным, однако его применение придает значениям индекса отцовства стабильность.

С этими исходными условиями статистическая оценка ДНКфингерпринтов множественных локусов основывается только на одном параметре: средней доле фрагментов ДНК (x), которые совпадают у людей без родственных связей. Такой параметр в большей степени зависит от техники лабораторных исследований, чем от свойств обследуемой популяции. Это прежде всего способность используемой системы к электрофоретическому разделению индивидуальных фрагментов ДНК (т.е. разрешающая способность используемого метода), принципы выбора конкретных фрагментов ДНК для

782

анализа, а также критерии принятия решения об идентичности сравниваемых фрагментов ДНК. Следовательно, параметр x может варьировать при сравнении результатов, получаемых в разных лабораториях, но эти различия будут постоянно сохраняться для различных популяций и субпопуляций. Действительно, при использовании, например зондов 33.6 и 33.15, оказалось, что x один и тот же у неродственных индивидуумов, в парах муж–жена и в различных этнических группах.

Рис. II.37. Сравнение информативности двух минисателлитных зондов при идентификации личности

Частоты встречаемости минисателлитных локусов D1S7 (а) и D1S80 (б) определенного размера в популяции оценивали гибридизацией по Саузерну после расщепления ДНК рестриктазой HaeIII (а) или ПЦР (б). Для локуса D1S7 характерно квази-непрерывное унимодальное распределение, тогда как локус D1S80 характеризуется меньшей гетерозиготностью (84%) с небольшим числом дискретных аллелей, для которых характерно мультимодальное распределение

783

Определение отцовства с использованием ДНК-зондов, специфичных в отношении только одного локуса. ДНК-фингерпринты,

получаемые при одновременном исследовании многих локусов, отражают скорее фенотип индивидуума, чем его генотип. Действительно, получаемая в итоге картина заключает в себе множество полос ДНК, в том числе и неразделившиеся, а также слабо разделившиеся фракции. Такая электрофореграмма напоминает сложный фенотипический признак, например форму лица человека, которая является результатом экспрессии громадного числа генов. В отличие от этого с помощью ДНК-зондов, представляющих собой клонированные последовательности минисателлитов и взаимодействующих только с одним локусом, можно получать истинную информацию о генотипе изучаемого организма. Таким образом, имея дело с отдельными полиморфными локусами человека, исследователи получают в свои руки систему кодоминантных аллелей (т.е. аллелей, совместно

участвующих в формировании фенотипических признаков), наследуемых по законам Менделя. Именно понимание наследования таких минисателлитных локусов и привело к широкому распространению однолокусного метода определения отцовства.

В настоящее время получены сотни клонов минисателлитной ДНК и на их основе разработаны комбинации зондов, пригодные для определения отцовства. При выборе зондов для таких минисателлитных локусов обычно руководствуются следующими критериями: зонды должны обладать строгой локус-специфичностью, а тестируемые локусы быть несцепленными (передаваться потомству независимо друг от друга) и обладать достаточной, но не чрезмерной генетической стабильностью. В частности, среди наиболее широко используемых зондов MS1 (D1S7) соответствует генетическому локусу, гетерозиготному в 99% случаев, однако он мутирует с очень высокой частотой (0,05 на гамету) и поэтому, несмотря на высокую информативность, не используется при определении отцовства (рис. II.37,а). В то же время для локуса D1S80 со значительно меньшей вариабельностью (84% гетерозигот) характерно образование кластеров в частотах распределения фрагмента ДНК по длине (см. рис. II.37,б). Поэтому небольшие ошибки в определении длины аллелей могут привести к значительным ошибкам в оценке частоты их встречаемости. Такие локусы достаточно легко изменяются в результате

784

генетического дрейфа и инбридинга.

В настоящее время разработана теория, указывающая на то, сколько локусов должно быть типировано для получения правильного ответа об отцовстве при известных значениях гетерозиготности этих локусов в популяции. Например, если используются локусы, гетерозиготность которых составляет 90%, для установления отцовства необходимо проанализировать шесть таких локусов. В США в настоящее время для этих целей обычно используется набор из трех–пяти однолокусных зондов. Однолокусные зонды обладают низкой разрешающей способностью относительно братьев и сестер (сибсов). В частности, с помощью одного такого зонда можно лишь с вероятностью 75% обнаружить генетические различия между сибсами, и эта вероятность увеличивается до 99,6% при использовании четырех зондов. Данный факт приобретает особую важность, когда при определении отцовства необходимо сделать выбор между братьями.

Особенности определения отцовства по отдельным локусам с использованием ПЦР. В качестве альтернативы однолокусным зондам в последнее время для определения отцовства часто используют ПЦР. Отдельные мини- и микросателлитные локусы могут быть амплифицированы с помощью праймеров, комплементарных уникальным последовательностям ДНК, фланкирующим эти повторяющиеся последовательности. При идентификации личности метод ПЦР, который по своей сути является одной из разновидностей однолокусной методики, поскольку имеет дело с отдельными локусами, обладает, по крайней мере, двумя преимуществами перед однолокусными зондами. Во-первых, популяционный полиморфизм длин ДНК аллелей, исследуемых с использованием этого метода, носит более дискретный характер, чем у аллелей, изучаемых с помощью однолокусных зондов (см. рис. II.37,а,б). Это обстоятельство облегчает последующее вычисление индекса отцовства. Во-вторых, метод ПЦР обладает гораздо большей чувствительностью и может быть использован при анализе образцов, содержащих <1 нг геномной ДНК и полученных из разных источников (см.

раздел 11.1.1).

К недостаткам ПЦР в применении к определению отцовства следует отнести низкую информативность полиморфных микросателлитов и коротких минисателлитов. Это связано с тем, что они обладают <90% гетерозиготности,

785

небольшим числом аллелей и имеют тенденцию к образованию кластеров по размерам (см. рис. II.37,б). Кроме того, на распределение таких последовательностей в геноме оказывают влияние инбридинг и принадлежность индивидуумов к определенным этническим группам. Количество локусов минисателлитов, которое необходимо исследовать методом ПЦР для определения отцовства, приближается к 11, а микросателлитов – к 18.

Для типирования с помощью ПЦР наиболее часто используются три минисателлитных локуса человека: в гене аполипопротеина B (APOB), D17S5 (известный также как локус D17S30) и D1S80. Все три локуса легко амплифицируются (максимальный размер их аллельных вариантов не превышает 1 т.п.о.) и легко обнаруживаются с помощью электрофореза. Однако для них характерны низкий уровень гетерозиготности и малая изменчивость (что выражается в небольшом числе известных аллелей). Мутации в этих микросателлитах возникают очень редко.

Одним из путей повышения информативности полиморфизмов микросателлитов при ДНК-типировании является одновременная амплификация двух тесно сцепленных микросателлитных локусов, сочетания которых формируют множество гаплотипов. Например, одновременная амплификация двух GATA-повторов, локализованных в интроне 40 гена фактора фон Виллебранда, которые разделены последовательностью длиной в 212 п.о., обнаружила суммарный уровень гетерозиготности объединенного локуса 93%. При этом уровни гетерозиготности индивидуальных локусов составляли лишь 72 и 78% соответственно.

В заключение необходимо еще раз отметить, что по своей логике современные методы определения отцовства, основанные на ДНКтипировании, несколько противоречивы. Если отрицательное заключение об отцовстве, основанное на несовпадении аллелей анализируемых миниили микросателлитных локусов, абсолютно и не подлежит сомнению, то положительный вывод может быть сделан лишь с некоторой долей вероятности, которая основана на частоте встречаемости конкретных аллелей анализируемых локусов в популяции. С другой стороны, в результате методических ошибок легко могут быть сделаны ложноотрицательные выводы, однако положительное заключение об отцовстве в результате лабораторной

786

методической ошибки практически исключено.

Высокая информативность многолокусных ДНК-фингерпринтов подтверждена большим числом генетических и популяционных исследований. Эмпирические данные, полученные при обследовании тысяч семей, показали, что с помощью многолокусных зондов можно разрешать все спорные случаи отцовства. Использование однолокусных зондов затруднено невозможностью создания полной классификации соответствующих аллелей в популяции из-за кажущегося непрерывного распределения их по размерам. Однако и в этом случае на практике проблема полностью решается с помощью набора из пяти– шести однолокусных зондов. Применение ПЦР ограничивается большой эволюционной консервативностью амплифицируемых мини- и микросателлитных локусов и, как следствие, малым суммарным числом аллелей. Однако ПЦР бывает очень полезна на первых этапах исследования из-за методической простоты постановки опытов, особенно в условиях малой доступности исходного биологического материала. Все три группы методов хорошо дополняют друг друга и в разных сочетаниях в спорных случаях позволяют однозначно идентифицировать личность человека.

11.3. Микроматрицы и микрочипы ДНК

Одним из интенсивно развивающихся направлений биотехнологии нуклеиновых кислот в последнее время становится использование микроматриц ДНК для анализа нуклеотидных последовательностей. В этой группе методов на небольшой по размеру поверхности стекла или другого твердого носителя иммобилизуют в виде правильно расположенных микропятен небольшие фрагменты ДНК с известной последовательностью нуклеотидов (чаще всего синтетические олигонуклеотиды или кДНК), которые далее используют для гибридизации с анализируемыми образцами нуклеиновых кислот. При совпадении первичной структуры ДНК микропятна и анализируемого образца на поверхности стекла образуются правильные ДНК– ДНК-гибриды, которые обнаруживаются по появлению в данных участках микроматрицы сигналов, например в виде микроскопической флуоресцирующей точки или по тушению флуоресценции исходно меченых последовательностей. Такие кусочки твердого носителя с нанесенными на них микроматрицами ДНК получили название микрочипов ДНК.

787

11.3.1.Методы создания микроматриц ДНК

Рис. II.38. Комбинаторный синтез олигонуклеотидов, иммобилизованных на твердой подложке

Последовательно предотвращая снятие защитных групп на определенных участках микроматриц (заливка серым цветом) удается соединять четыре нуклеотида во всех возможных комбинациях. В данном примере за 12 (4 х 3) стадий синтеза синтезированы все возможные (34 = 81) тримеры олигонуклеотидов

788

Для нанесения нуклеиновых кислот на поверхность подложки в основном используют три подхода: короткие олигонуклеотиды синтезируют прямо на ее поверхности, а также прикрепляют к ней предварительно полученные фрагменты ДНК ковалентными или нековалентными связями.

Во время синтеза олигонуклеотидов непосредственно на поверхности стекла применяют те же реагенты и проходят те же стадии, что и при обычном твердофазном синтезе в современных автоматических синтезаторах. В наиболее распространенном варианте при создании микроматрицы используют фотолитографическую маску, которая избирательно закрывает от света и оставляет открытыми участки микроматрицы с синтезируемыми олигонуклеотидами, содержащими чувствительные к облучению светом защитные химические группы. На каждом этапе синтеза маску, которая на схеме обозначена серыми прямоугольниками, помещают над большей частью микроматрицы, а остающиеся открытыми химические группы активируют светом. Затем происходит соединение 5’-гидроксильных групп фосфорамидитных производных добавляемого нуклеотида с активированным сегментом микроматрицы.

Защищая поверхность микроматрицы от света дискретными участками в различных простых комбинациях, удается синтезировать, как это показано на схеме (рис. II.38), за 4·3 = 12 отдельных этапов все теоретически возможные последовательности тринуклеотидов в количестве 34 = 81. В общем случае для синтеза всех возможных последовательностей длиной в N нуклеотидов требуется 4N синтетических стадии. Длина цепи олигонуклеотида, который может быть синтезирован на микроматрице, лимитируется выходом готового продукта на каждой стадии, который составляет 95%. Так, суммарный выход

25-звенного олигонуклеотида будет составлять всего (0,95)25 = 28%. В этой связи рассмотренный метод обычно используют для синтеза олигонуклеотидов, длина которых не превышает 20–25 оснований.

При альтернативном подходе микроматрицы олигонуклеотидов синтезируют на подложке с использованием технологии струйных принтеров. В этом случае головка принтера движется вдоль подложки и, в соответствии с заложенной программой, наносит на необходимые участки небольшие количества раствора с фосфорамидитными производными нуклеотидов из индивидуальных резервуаров. Этапы снятия защитных групп и промывания

789

производятся так же, как и при обычном твердофазном синтезе олигонуклеотидов. Эффективность каждого этапа синтеза в этом случае может превышать 99%, что позволяет синтезировать олигонуклеотиды длиной до 40 оснований с суммарным выходом 67% (40 этапов с выходом 99% на этап).

Еще одной разновидностью методов создания микроматриц является синтез индивидуальных олигонуклеотидов, их очистка и нанесение с помощью микроробота на поверхность подложки с адгезивным покрытием. Однако создание этим способом микроматриц, содержащих тысячи индивидуальных элементов, – очень трудоемкий процесс.

При конструировании микроматриц, элементы которых содержат индивидуальные кДНК, для нанесения на подложку микропятен чаще всего используют микророботы. В этом случае применяют растворы рекомбинантных кДНК длиной 0,5–1,0 т.п.о., очищенных из бактериальных клеток, которые перед применением как правило, амплифицируют с помощью ПЦР. Поверхность стеклянной подложки покрывают тонким слоем полилизина или обрабатывают аминосиланом с целью создания на ней положительного заряда, что обеспечивает возможность электростатического взаимодействия подложки с отрицательно заряженными молекулами кДНК. Недостатком этого способа является неспецифичность электростатических взаимодействий, в которые вовлечены многие участки кДНК, что уменьшает эффективность взаимодействия кДНК с последовательностями анализируемых образцов. Для преодоления этих затруднений с помощью асимметричной ПЦР синтезируют производные кДНК, которые далее ковалентно соединяют с сиалированным стеклом с помощью боргидрида.

Разрабатываются и альтернативные конфигурации микроматриц, в которых на поверхности стекла фиксируют сами фрагменты ДНК, анализируемой с помощью олигонуклеотидных зондов. Такой подход был использован, в частности для поиска мутаций в гене белка p53. Дальнейшим расширением этого подхода является нанесение на поверхность стекла кусочков тканей с последующим анализом содержащихся в них ДНК или РНК гибридизацией in situ.

790

11.3.2.Ограничения в использовании микроматриц ДНК

Помимо самой достаточно сложной технологии производства микроматриц, к числу факторов, ограничивающих их широкое применение, относятся кинетические параметры гибридизации, а также точность и чувствительность обнаружения в гибридах ошибочно спаренных нуклеотидов.

Кинетика гибридизации. Гибридизация в гетерогенных смесях нуклеиновых кислот происходит медленно. При использовании олигонуклеотидов в качестве зондов для ее завершения обычно требуется несколько часов, тогда как в случае зондов кДНК процесс продолжается в течение 6–24 ч при высокой температуре. Поиск зондом своей иммобилизованной мишени происходит двумя путями. Во-первых, может произойти прямая гибридизация непосредственно из раствора, эффективность которой в первом приближении не зависит от размера зонда. Во-вторых, зонд вначале может неспецифически связаться с поверхностью подложки, диссоциировать из комплекса и, диффундируя вдоль поверхности, достичь мишени. Скорость гибридизации по второму механизму резко возрастает, когда длина зонда становится меньше 1000 нуклеотидов. С учетом этого время, необходимое для гибридизации, может быть уменьшено путем укорачивания молекулы зонда, повышения его концентрации в гибридизационных смесях и сокращения расстояния, которое необходимо преодолеть зонду до мишени путем диффузии.

Поскольку концентрация зондов в гибридизационных смесях ограничена их химическими свойствами, основным фактором, с помощью которого можно уменьшать время гибридизации и объем наносимого образца с зондом, становится плотность расположения пятен ДНК-мишеней (элементов) в микроматрицах. Размеры индивидуальных элементов микроматриц, получаемых современными фотолитографическими методами, лежат в пределах 5–10 мкм при общей их максимальной плотности на подложке106/см2. Плотность элементов в обычно используемых микрочипах, полученных с помощью фотолитографии, составляет 104–105/см2. При использовании микророботов для нанесения кДНК на поверхность подложки плотность расположения элементов достигает лишь 103/см2. И в том, и в другом случае зондам для гибридизации необходимо диффундировать к