Экспрессия генов Патрушев

751

делецией, затрагивающей участок хромосомы 13q14, а пациенты с нормальным кариотипом содержат делецию в локусе RB1, обнаруживаемую гибридизацией по Саузерну. Для пациентов с делециями в локусе RB1 характерна предрасположенность и к другим онкологическим заболеваниям. Риск заболевания ретинобластомой детей у родителей с делециями в локусе RB1 может быть существенно уменьшен, если в клетки зародышевой линии родителей ввести недостающий участок генома. Аналогичные результаты могут быть получены при лечении болезни Леша–Нихана методами генотерапии на клетках зародышевой линии. Данный синдром вызывается дефицитом фермента пуринового метаболизма гипоксантингуанозинфосфорибозилтрансферазы. У пациентов идентифицированы 17 независимых мутаций в гене, расположенном на длинном плече X-хромосомы и кодирующем этот фермент.

Хорошо изучена также этиология болезни Тэя–Сакса. Для пациентов характерно полное отсутствие активности β-гексозаминидазы, что сопровождается накоплением ганглиозидов или сложных сфинголипидов в лизосомах. Несмотря на разнообразие клинических проявлений болезни обнаружены только две мутации в гене β-гексозаминидазы, одна из которых является вставкой 4 п.о. в экзоне 11, а другая расположена в сайте сплайсинга интрона 12.

Метахроматическая лейкодистрофия характеризуется дефицитом арилсульфатазы A и наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Субстратом фермента является гликолипид цереброзидсульфат, который входит в состав миелина. Во время заболевания цереброзидсульфат накапливается в лизосомах, что приводит к прогрессирующей демиелинизации нейронов. Ген арилсульфатазы A локализован на хромосоме 22. Три мутации описаны в аллеле I этого гена: две из них, расположенные в кодирующей части, приводят к замене Tyr-193→Ser, а третья нарушает донорный сайт сплайсинга на границе экзона 2. Таким образом, превентивная генотерапия трех вышеперечисленных наследственных заболеваний потребовала бы точной замены мутантных аллелей на нормальные в клетках зародышевой линии носителей этих мутаций.

В отличие от генотерапии на уровне клеток зародышевой линии

752

генотерапия с использованием соматических клеток сопряжена с меньшими трудностями и потенциально может быть применена для лечения ряда генетических заболеваний. Одним из существенных преимуществ работы с соматическими клетками является меньшая опасность от внесения в геном соматических клеток мутаций вследствие инсерционного мутагенеза. Это связано с тем, что распространение таких мутаций будет ограничено сравнительно небольшим клоном соматических клеток. Большинство предложений по генотерапии с использованием соматических клеток связано в настоящее время с лечением онкологических заболеваний.

Возможность применения генотерапии, объектом которой будут клетки зародышевой линии человека, ставит ряд этических проблем. Прежде всего, при современном уровне развития генетики неизбежен большой риск внесения наследуемых повреждений в геном человека, и такие повреждения будут носить необратимый характер. Кроме того, с развитием генотерапии будет возникать соблазн использования ее достижений для усиления физических возможностей человека. Генетические и социальные последствия такого рода вмешательства в генетическую природу человека в настоящее время непредсказуемы. Исходя из этого, более безопасной представляется генотерапия с использованием генов соматических клеток человека, и именно здесь успехи генной инженерии возможны в ближайшее время.

10.5.5.Успехи генотерапии в модельных экспериментах

Впоследнее время получены впечатляющие результаты и по коррекции дефектов на генном уровне с помощью направленного переноса генов в клетки мышей. Одним из таких примеров является успешная генотерапия мышей с синдромом shiverer (дрожание конечностей). У этих мышей имеется мутация в гене, кодирующем основной белок миелина, что фенотипически проявляется в виде тремора и конвульсий. Введение гена дикого типа в клетки зародышевой линии больных мышей приводило к рождению фенотипически здоровых особей. У потомства карликовых мышей, не способных синтезировать гормон роста и развившихся из клеток зародышевой линии, в которые ввели гибридный ген металлотионеина и ген гормона роста крыс, наблюдали восстановление способности к нормальному росту и развитию. Путем введения в клетки зародышевой линии гена дикого типа гонадотропин-рилизинг-гормона удалось

753

восстановить репродуктивную способность у потомства мышей, родители которых были стерильны из-за отсутствия у них этого гормона и, как следствие, недоразвития гонад. В подобных же опытах введение клонированных β-

глобиновых генов человека в клетки мышей с β-талассемией сопровождалось восстановлением нормального фенотипа у клеток красной крови и коррекцией анемии. Для мышей, моделирующих сцепленную с X-хромосомой недостаточность по орнитинтранскарбомоилазе, характерны облысение, изменение формы волос и повреждение кожи. Нормальный фенотип восстанавливался у потомства мышей, развившихся из клеток зародышевой линии, в которые был введен ген транскарбомоилазы дикого типа. При этом восстанавливалась даже нормальная экскреция оротовой кислоты. Интересные результаты были получены при попытке проведения генотерапии у мышей с синдромом диабета линии NOD (nonobese diabetic), заболевание которых, повидимому, имеет аутоиммунную этиологию, что обусловлено дефектными генами главного комплекса гистосовместимости. У трансгенных мышей, экспрессирующих нормальные гены, не наблюдали воспалительных реакций в островках Лангерганса панкреатической железы и синдрома диабета.

На мышах моделировали также синдром мукополисахаридоза типа VII, для которого характерно нарушение ступенчатой деградации глюкозаминогликанов в лизосомах. Введение нормального гена β- глюкуронидазы человека таким мышам приводило к коррекции как фенотипа, так и самого биохимического нарушения, приводящего к этому фенотипу.

10.5.6.Проблемы, возникающие в связи с практическим применением

генотерапии

Несмотря на впечатляющие успехи генотерапии на модельных животных, в настоящее время имеется ряд принципиальных затруднений, препятствующих широкому использованию метода для лечения заболеваний человека. При проведении генотерапии необходимо выполнять, по крайней мере, следующие условия. Каждый ген, интегрированный в геном человека, должен нормально экспрессироваться и в случае необходимости адекватно отвечать на регуляторные сигналы организма. Интеграция гена в геном не должна сопровождаться инсерционным мутагенезом, нарушающим

754

функционирование жизненно важных генов, и вообще оказывать неблагоприятное генетическое действие. При этом дефектный ген не должен оказывать отрицательного влияния на функционирование трансгена. Необходимо помнить, что частота интеграции вводимого гена в геном эмбриональных клеток сильно варьирует от клетки к клетке, хотя и несколько возрастает при использовании ДНК в линейной форме, а также при увеличении числа копий генов, вводимых в пронуклеус. Интеграция гена часто сопровождается точковыми мутациями, делециями, дупликациями и перестройками ДНК. Кроме того, интеграция генов в геном, как правило, носит случайный характер, что затрудняет введение гена в требуемый участок генома и может сопровождаться инсерционным мутагенезом. Следствием инсерционного мутагенеза может быть инактивация жизненно важных генов или же превращение протоонкогенов в онкогены.

Ни одна из вышеперечисленных технических проблем, возникающих при практическом использовании генотерапии, не является неразрешимой, однако преодоление этих трудностей требует времени. Реализация международного проекта "Геном человека" даст возможность исследователям использовать на практике от 80 000 до 100 000 генов человека, в том числе и для генотерапии. Все это создает реальные перспективы преодоления многих заболеваний человека, считающихся неизлечимыми.

755

ГЛАВА 11.ДНК-ДИАГНОСТИКА И ДНК-ТИПИРОВАНИЕ

Рис. II.30. Генетические последствия мутаций, происходящих в геноме соматических клеток человека на разных стадиях эмбриогенеза

Черным цветом закрашены места локализации клонов мутантных клеток разных размеров в организме человека

Исследования показывают, что большинство заболеваний человека, а возможно, и все его болезни связаны с мутациями, приводящими к изменению уровней экспрессии конкретных генов. Мутации в определенных генах нарушают функционирование биохимических систем, что в конце концов приводит к развитию соответствующих патологических состояний организма (рис. II.30). В том случае, если мутации происходят в геноме клеток

756

зародышевой линии человека, все соматические клетки организма-потомка, который развивается из мутантной зиготы, образовавшейся от слияния мутантных гамет в процессе оплодотворения, будут содержать указанную мутацию. Чем позже в онтогенезе человека возникает соматическая мутация, тем меньше размер клона мутантных клеток во взрослом организме. Если же мутация доминантна, т.е. патологический мутантный признак, определяемый мутантным геном, проявляется даже при наличии в соматических клетках копии нормального гена, полученного от другого родителя, то возникает наследственное заболевание.

В случаях, когда мутация, определяющая мутантный фенотип, рецессивна (ее действие проявляется лишь в гомозиготном состоянии, при котором один и тот же мутантный ген получен от каждого из родителей), можно говорить о предрасположенности организма-гетерозиготы к соответствующему заболеванию и носительстве мутантного гена. Действительно, организм, у которого действие рецессивной мутации маскируется функционированием другого, полноценного аллеля, внешне (фенотипически) выглядит нормальным. Однако у такого организма гораздо больше шансов дать больное потомство в браке с носителем такого же мутантного гена, что является одной из причин запрета на близкородственные браки. С другой стороны, у носителей мутантных генов в гетерозиготном состоянии может произойти соматическая мутация в соответствующем аллельном гене соматических клеток, что также станет причиной развития приобретенного генетического заболевания. В качестве одного из примеров такого заболевания мы уже рассматривали ранее ретинобластому – онкологическое заболевание, поражающее сетчатку глаз, чаще всего, в детском возрасте. Это заболевание развивается в два этапа: вначале организм ребенка получает от одного из родителей мутантный ген RB1, являющийся рецессивным онкогеном (антионкогеном), а затем в онтогенезе в одной из соматических клеток в результате мутации происходит инактивация второй его копии, что вызывает малигнизацию клетки и развитие опухоли. Такой же механизм лежит в основе возникновения некоторых форм диабета, а также ряда онкологических и аутоиммунных заболеваний.

Традиционная диагностика наследственных и инфекционных заболеваний строится на детальном изучении симптомов и проведении многочисленных биохимических анализов, включая культивирование

757

патогенных микроорганизмов на сложных питательных средах. При этом выявление бессимптомного носительства вредных аллелей и микроорганизмов-возбудителей превращается в чрезвычайно трудоемкую задачу. В частности, традиционными цитогенетическими методами можно выявить в геноме человека лишь некоторые крупные хромосомные перестройки: протяженные делеции и транслокации генетического материала, потерю или приобретение целых хромосом. При этом мелкие делеции, транслокации и вставки, а также точковые мутации, которые являются наиболее часто встречающимися изменениями генетического материала, остаются не обнаруженными. То же имеет место и при диагностике бессимптомного носительства возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы, например вируса иммунодефицита человека, которые в латентной стадии инфекции могут присутствовать в организме человека лишь в небольшом числе копий.

Разработанные недавно новые методы молекулярной биологии, и особенно метод ПЦР, значительно облегчили проведение диагностики наследственных и инфекционных заболеваний. При этом мутации выявляются в ДНК клинических образцов, а бессимптомное присутствие возбудителей обнаруживают по наличию геномных ДНК или РНК соответствующих вирусов или бактерий.

В основе всех методов ДНК-диагностики лежат три фундаментальных принципа молекулярной биологии (рис. II.31). Это прежде всего существование комплементарных взаимодействий между двухцепочечными молекулами нуклеиновых кислот (первый принцип), которые после денатурации с последующей ренатурацией (второй принцип) позволяют им безошибочно находить друг друга и восстанавливать первоначальную вторичную структуру. Если же в процессе ренатурации нуклеиновых кислот добавить в пробы короткие олигонуклеотиды (зонды или праймеры), ковалентно соединенные с каким-либо меченым соединением, то они благодаря комплементарным взаимодействиям соединяются с тем участком нуклеиновой кислоты, который содержит последовательность нуклеотидов, строго соответствующую последовательности нуклеотидов зонда или праймера (третий принцип). Следовательно, наличие связавшейся с нуклеиновой кислотой метки с высокой точностью свидетельствует о присутствии в анализируемом образце искомых

758

последовательностей нуклеотидов.

Рис. II.31. Три молекулярно-генетических принципа, лежащих в основе ДНК-диагностики

Звездочками отмечено наличие радиоактивной, флуоресцентной или другой метки в олигонуклеотидных зондах или праймерах на одном из их концов

Современные методы ДНК-диагностики находят широкое применение в медицине для обнаружения мутаций при наследственных (или приобретенных) заболеваниях и ДНК-типирования организмов (рис. II.32). ДНК-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний может заключаться как в обнаружении известных, уже описанных мутаций, так и в поиске новых мутаций, приводящих к тому же патологическому состоянию организма. ДНКтипированием называют поиск генотипических особенностей у микроили макроорганизма, которые позволяют его идентифицировать и(или) отнести к той или иной систематической группе.

759

Рис. II.32. Применение методов ДНК-диагностики в медицине

11.1. ДНК-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний

Для проведения ДНК-диагностики наследственных и приобретенных заболеваний необходимо подготовить нуклеиновые кислоты, содержащиеся в клинических образцах, и проанализировать их адекватными методами. При этом целью анализа является обнаружение в геноме больного известных или новых мутаций, ассоциированных с развитием мутантного фенотипа в виде симптомов конкретного заболевания.

11.1.1.Получение клинического генетического материала

Для проведения ПЦР используют ДНК клеток различных органов и тканей человека. Основными требованиями, предъявляемыми к такой ДНК, является отсутствие сильной ее деградации и повреждений химическими агентами. Источниками клеток для выделения ДНК служат слюна и другие биологические жидкости пациентов, свежая или высушенная кровь, биоптаты различных тканей, в том числе и корни волос, а также консервированные ткани.

Слюну пациентов (до 5 мл) обычно собирают в пластиковые пробирки. Допускается сбор слюны на фильтровальную бумагу с последующим ее высушиванием с целью облегчения транспортировки. Поскольку источником

760

ДНК в слюне являются соматические клетки слизистых, а также присутствующие в ротовой полости микроорганизмы, необходимо предпринимать усилия для их механического освобождения с внутренней поверхности щек, например движениями языка или используя специальные щеточки. В лаборатории белки слюны расщепляют протеиназой К, а освободившуюся ДНК дополнительно депротеинизируют фенолом и концентрируют осаждением спиртом.

Корни волос содержат несколько сотен соматических клеток, а следовательно, и адекватное число копий ДНК, достаточное для проведения ПЦР. При использовании ДНК из этого источника из-за малого ее содержания необходимо применять особые меры предосторожности против ее загрязнения посторонними ДНК. Преимуществом корней волос перед другими источниками ДНК является почти полное отсутствие внеклеточного матрикса, затрудняющего выделение ДНК из соматических клеток. Это позволяет исключать стадию фенольной обработки образцов для получения ДНК, пригодной для проведения ПЦР. Клетки корней волос лизируют буфером, содержащим неионные детергенты, белки гидролизуют протеиназой К, которую далее инактивируют прогреванием при 100о . При этом одновременно происходит денатурация ДНК, что необходимо для проявления ее матричных свойств при проведении ПЦР.

Срезы для микроскопии и парафинированные ткани используют для проведения семейного генетического анализа, когда другие возможные источники ДНК недоступны из-за смерти пациента или по другим причинам. Для фиксации тканей при проведении патологоанатомических исследований часто используют формальдегид или глутаровый альдегид, которые модифицируют основания ДНК. Поэтому при использовании ДНК из срезов фиксированных тканей возможна амплификация лишь коротких ее сегментов длиной в несколько сотен пар оснований.

Ткани, освобожденные от парафина ксилолом или октаном или же соскобленные с препаратов для микроскопии, суспендируют в лизирующем буфере с протеиназой К и инкубируют в течение 12–24 ч при 56–65о для протеолитического расщепления белков. Дальнейшую депротеинизацию образцов и осаждение ДНК осуществляют так же, как и в предыдущем случае.