Экспрессия генов Патрушев

731

увеличением веса и существенным уменьшением содержания жира в тканях. Другое направление биотехнологии, в котором используется трансгеноз,

– изучение возможности биосинтеза чужеродных белков в клетках молочных желез млекопитающих с последующей их секрецией в молоко. Идея этого подхода заключается в применении молочных желез крупных сельскохозяйственных животных в качестве биореакторов для биосинтеза биологически активных пептидов и белков. Предполагалось, что в результате экспрессии трансгенов в клетках молочных желез удастся синтезировать рекомбинантные белки, претерпевшие правильные посттрансляционные модификации (в частности гликозилирование), что, как правило, не удается делать в других генетических системах.

Уже в первых опытах с трансгенами тканевого активатора плазминогена (tPA) человека, интегрированными в геном в виде кДНК, была показана возможность специфической экспрессии его в молочных железах мышей, причем содержание функционально активного tPA составляло около 0,1 мг на 1 мл. Похожие результаты были получены с трансгенами фактора IХ коагуляции крови, α1-антитрипсина, γ-интерферона, фолликулостимулирующего гормона и интерлейкина 2 человека, а также ряда других белков, имеющих значение для биотехнологии.

Во всех вышеперечисленных направлениях исследований усилия были сосредоточены на получении трансгенных животных-биореакторов, секретирующих в молоко белковые продукты экспрессии трансгенов, что предполагает их дальнейшую очистку. В отличие от этого в других исследованиях предпринимались попытки изменения формулы и питательных свойств молока. В частности, Дж. Симмонсу с соавторами удалось получить экспрессию гена β-лактальбумина овец в молочных железах трансгенных мышей. Авторы не исключали принципиальной возможности сделать состав молока крупных сельскохозяйственных животных более пригодным для новорожденных детей или людей, обладающих повышенной чувствительностью к лактозе.

732

10.3.4.Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний

человека

Для разработки эффективных методов лечения наследственных и приобретенных заболеваний человека, а также для полного понимания их этиологии требуется моделирование соответствующих симптомов на лабораторных животных. В этом случае проблема заключается в направленном введении мутаций в гены организма животных, инактивация которых приводит к развитию патологических процессов. Разработка эффективных методов получения трансгенных животных позволила исследователям вплотную подойти к решению данного вопроса.

Основой для решения послужили две работы, выполненные М. Хупером и М. Куэном с соавторами и опубликованные в 1987 г. Авторам удалось разработать общий подход к избирательной инактивации генов в организме животных. Мишенью для инактивации стал ген гипоксантин-гуанозин- фосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ), нефункциональное состояние которого у человека приводит к развитию заболевания Леша–Нихана. Мышей, дефектных по гену ГГФРТ, получали из эмбриональных стволовых клеток линии ES, инактивируя ген с помощью спонтанных мутаций или интегрируя в него геном ретровирусов (разновидность инсерционного мутагенеза). Клетки с инактивированным геном ГГФРТ удобно отделять от клеток дикого типа на селективной питательной среде в присутствии 6-тиогуанина. Позднее было показано, что инактивация гена ГГФРТ может быть достигнута путем гомологичной рекомбинации гена дикого типа с мутантным геном или его частью, которые вводят в клетки ES с помощью электропорации или микроинъекций в составе линеаризованных векторных плазмид. Основная проблема, возникающая при инактивации гена-мишени с помощью гомологичной рекомбинации, заключается в низкой частоте (~10-6) рекомбинационных событий, приводящих к правильной интеграции экзогенной последовательности нуклеотидов в инактивируемый ген. Эта проблема в настоящее время решается путем отбора требуемых мутантных клеток из общей популяции клеток, в которых интеграция инактивирующего вектора в хромосомы произошла случайным образом.

733

Рис. II.29. Схема адресной доставки генов в геном эмбриональных стволовых клеток с использованием гомологичной рекомбинации ("генный нокаут")

Показано положение гена устойчивости к неомицину (neo), интегрированного в экзон 2 инактивируемого гена, который используется для позитивного отбора, а также гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (tk), используемого для негативной селекции клеток в присутствии ганцикловира

Чтобы создать селективные условия отбора, в последовательности нуклеотидов рекомбинантной ДНК, гомологичные последовательностям инактивируемого гена, вводят доминантный селектируемый маркер в виде гена

734

устойчивости к антибиотикам (например neo), который экспрессируется только в случае правильной интеграции в ген-мишень под контроль его регуляторных элементов. Другая, более эффективная система отбора основана на одновременном проведении негативной и позитивной селекции клеток, у которых произошла правильная интеграция инактивирующего вектора. В этой системе помимо доминантного селектируемого маркера neo инактивирующий вектор содержит другой маркерный ген, экспрессия которого приводит к гибели клеток ES на селективной среде. Маркерным геном часто является ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk), принцип действия которого был рассмотрен выше. Ген HSV-tk вводится в инактивирующий вектор таким образом, что он удаляется в результате гомологичной рекомбинации и сохраняется в хромосоме в случае неспецифической интеграции рекомбинантной ДНК, что приводит к цитотоксическому эффекту. Обобщенная схема направленного введения мутаций в гены животных in vivo, которые приводят к их инактивации во всех клетках трансгенного организма ("генный нокаут"), представлена на рис. II.29.

Разработка универсальных методов направленной инактивации любого требуемого гена во всех клетках организма трансгенных животных позволила за короткое время создать модели таких наследственных заболеваний человека, как β-талассемия, мышечная дистрофия Дюшенна, серповидно-клеточная анемия, муковисцидоз, болезнь Леша–Нихана и целого ряда других распространенных синдромов. Создание этих методов открыло также возможности генотерапии наследственных заболеваний путем замещения в клетках зародышевой линии мутантных аллелей на нормальные. Результаты, полученные в этой области, будут обсуждаться в разделе 10.5.

Следует подчеркнуть, что инактивация генов-мишеней у лабораторных животных – не единственный способ моделирования наследственных и особенно приобретенных заболеваний человека, поскольку причиной многих заболеваний является не отсутствие функционирования, а сверхэкспрессия определенных генов. Например, высокий уровень экспрессии трансгена аполипопротеина AII сопровождается развитием острого атеросклероза у трансгенных мышей. Только исчерпывающее знание этиологии заболевания допускает его адекватное моделирование, и, наоборот, лишь создание адекватных моделей может убедить исследователя в том, что он правильно

735

понимает его природу.

10.4. Трансгенные растения

Способность к вегетативному размножению отличает организм растений от организма высших животных, что заметно облегчает осуществление трансгеноза. Многие клетки растений, например клетки зародыша на ранних стадиях его развития, покоящиеся клетки меристем кончиков побегов и корней, а также сосудистых тканей камбия, находятся в недетерминированном состоянии и, попадая под влияние внешних воздействий, могут дифференцироваться с образованием клеток любых типов, а также давать начало новым растениям. В частности, перенос в питательную среду таких недетерминированных клеток может приводить к их полной дедифференцировке и формированию в культуре недифференцированной ткани каллуса. Такие клетки могут стабилизироваться в жидких суспензионных культурах и расти неограниченно долго. Из недифференцированных тканей многих видов растений можно легко регенерировать целые растения.

Процесс получения трансгенных растений в этом случае начинается с введения требуемых генов в недифференцированные клетки таким образом, чтобы они интегрировались в хромосомы. Введение чужеродных генов в клетки растений облегчается, если их клеточные стенки удаляют с помощью гидролитических ферментов - пектиназы и(или) целлюлазы, что приводит к образованию протопластов. Чужеродные гены, находящиеся в составе векторных плазмид, вводят в протопласты одним из стандартных способов с использованием эндоцитоза, стимулированного полиэтиленгликолем, электропорации, микроинъекций или бомбардировки микрочастицами, нагруженными векторной ДНК. После этого протопласты в течение нескольких дней культивируют на питательной среде для восстановления клеточных стенок и образующиеся клетки-трансфектанты используют для регенерации целых растений.

Основным направлением применения трансгеноза для генетической модификации культурных растений является повышение их устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, в частности вирусам и гербицидам. Один из таких подходов, в котором антисмысловые РНК были направлены на подавление экспрессии жизненно важных генов вирусов, уже

736

был рассмотрен в разделе 9.1.2.

Другой метод защиты растений от вирусов с помощью трансгенов, предложенный В. Шибальским в 1988 г., успешно используется в настоящее время. Сущность метода заключается во введении в геном растений транс- действующих доминантных летальных генов или, по терминологии Шибальского, "анти-генов", которые кодируют измененные мутациями белки вирусов, существенные для их воспроизводства, и путем конкурентного замещения соответствующих белков вируса дикого типа прерывают его размножение. В частности, с использованием такого подхода удалось получить очень высокую устойчивость растений к вирусу Х картофеля (PVX). В этом случае в ген репликазы PVX с помощью направленного мутагенеза вводили мутации, сопровождающиеся заменой аминокислот в консервативном участке полипептидной цепи репликазы, ассоциированном с ее каталитическим сайтом. Для экспрессии мутантного трансгена в растениях табака были характерны внутриклеточное накопление инактивированной репликазы и появление высокой устойчивости растений к заражению вирусом PVX.

Еще один современный подход к получению трансгенных растений, устойчивых к вирусам, основан на введении в них трансгенов, экспрессирующих в клетках моноклональные антитела, направленные против вирусных белков. В одной из работ с использованием такого метода создали эффективную систему защиты растений от вируса морщинистой мозаики артишока (AMCV). Для этого сначала получили панель моноклональных антител к вирусу AMCV и отобрали гибридомы, продуцирующие антитела, которые взаимодействуют с консервативными участками белка оболочки вируса. Клетки гибридомы использовали для конструирования библиотеки кДНК, из которой выделили последовательности нуклеотидов, кодирующие полноразмерные тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов G класса 2b. С помощью ПЦР и универсальных праймеров амплифицировали вариабельные участки этих последовательностей (VH и VL), которые далее клонировали в экспрессирующем векторе E. coli, что сопровождалось образованием полипептидов VH и VL, соединенных линкерным пептидом (антитела scFV). После отбора клонов, продуцирующих высокоаффинные антитела к вирусному антигену (scFV), объединенные таким образом гены VH-VL помещали в экспрессирующий вектор и использовали для получения трансгенных растений

737

табака Nicotiana bentamiana. Трансгенные растения содержали в своих клетках до 0,1% антител от суммарного белка и оказались устойчивыми к AMCVинфекции, но не к вирусу мозаики цветной капусты (CMV), что указывало на специфический характер их резистентности.

В заключение следует упомянуть о работе, в которой трансгенные растения сорго, устойчивые к гербицидам, получали бомбардировкой незрелых эмбрионов на стадии зиготы микрочастицами золота (диаметр частиц – 1,5–3,0 мкм). В таком случае микрочастицы погружали в раствор экспрессирующего вектора, высушивали и "выстреливали" в клетки-мишени, добиваясь при этом высоких результатов трансфекции.

10.5. Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний

Современные методы лечения наследственных и приобретенных заболеваний связаны с введением в организм больного недостающих продуктов метаболизма или с ограничением поступления их предшественников с пищей, как это происходит, например, в случае диабета и т.п. Практикуется введение в организм и самих продуктов экспрессии поврежденного гена, а именно: ферментов или пептидных гормонов. Естественно, что подобная терапия лишь временно снимает симптомы заболевания и не устраняет его причины. Радикальным способом лечения таких заболеваний было бы исправление генетического дефекта, приводящего к развитию заболевания, путем введения в геном организма функционально активного гена. Современный уровень развития генной инженерии в принципе позволяет разрабатывать подходы к решению возникающих в связи с этим проблем, поскольку основные методы получения трансгенных животных и растений могут быть использованы и для манипулирования генами человека.

Теоретически возможны два типа генно-инженерных воздействий на геном человека с целью генотерапии. Во-первых, это вмешательство на уровне соматических клеток, приводящее к созданию клона клеток с измененным генотипом, которые могут повлиять на фенотип организма в целом. Во-вторых, воздействие на клетки зародышевой линии. В этом случае все клетки организма следующего поколения будут генетически изменены и такие изменения будут передаваться из поколения в поколение. Объектами генноинженерных воздействий служат как половые клетки до оплодотворения, так и

738

эмбриональные клетки на ранних стадиях развития зародыша до его имплантации. При работе с соматическими клетками достаточно введения дополнительной копии нормального гена, который может существовать в геноме наряду с его поврежденным гомологом. В отличие от этого в случае генотерапии на уровне клеток зародышевой линии необходимо производить замещение мутантного гена нормальным, так как современный уровень знаний не позволяет предсказать фенотипические последствия одновременного присутствия в геноме нормального и мутантного аллелей гена и их влияние на процессы роста и развития организма.

В настоящее время генотерапия рассматривается как многообещающее направление в развитии способов лечения широкого круга заболеваний человека как моногенной, так и полигенной (многофакторной) этиологии. При этом обработку клеток-мишеней трансгенами можно осуществлять как в организме человека, так и ex vivo, т.е. за его пределами. В последнем случае соматические клетки (чаще всего крови) больного подвергают генноинженерному воздействию вне организма, после чего вводят их обратно. При всех этих генно-инженерных манипуляциях с трансгенами в первую очередь обращают внимание на генетическую безопасность подобных операций т.е. предотвращение нежелательных побочных эффектов трансгенов. Кроме того, после направленной доставки трансгенов к клеткам-реципиентам необходимо обеспечивать контроль за уровнем их экспрессии, а также, в идеальном случае, возможность изменения этого уровня, т.е. регулировать экспрессию трансгенов. Рассмотрим подробнее современную технику введения трансгенов при генотерапии, чаще всего используемую в клиниках, а также методы, обеспечивающие контроль их экспрессии в организме больного.

10.5.1.Способы доставки новых генов в геном человека

Ретровирусные векторы. Для доставки трансгенов в организм человека в целях генотерапии ретровирусные векторы используются наиболее широко и являются одним из наиболее эффективных средств доставки генетического материала в геном человека. Специфичность взаимодействия ретровирусов с поверхностью клеток-мишеней в момент заражения обеспечивается белком оболочки их вириона, кодируемого геном env, продукт которого контактирует с белком-рецептором заражаемых клеток. Это создает предпосылки для

739

направленного изменения круга хозяев вируса, т.е. клеток, которые он может заражать, путем изменений белка вирусной оболочки. Многие ретровирусы обладают ограниченным кругом хозяев вследствие функционирования вышеупомянутого механизма. Классическим примером такого рода является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), который способен заражать лишь субпопуляцию лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности рецептор

CD4.

Наиболее пристальное внимание как к средству доставки трансгенов при генотерапии уделяется вирусу лейкоза мышей Молони (MoMLV). Вирусы группы MoMLV-E обладают способностью заражать практически все исследованные клетки грызунов (вирусы с кругом хозяев, который не выходит за рамки организмов, обычно заражаемых такими вирусами, получили название экотропных). В отличие от этого вирусы группы MoMLV-А способны заражать большое число клеток млекопитающих, включая клетки человека (вирусы с широким кругом хозяев получили название амфотропных). В настоящее время разрабатываются три основные стратегии искусственного изменения тропизма (круга хозяев) вирусов этих групп, что необходимо для доставки трансгенов в клетки человека: прямое изменение последовательности нуклеотидов гена белка оболочки ретровирусов, соединение белка оболочки с новыми лигандами и псевдотипирование.

Модификации гена белка оболочки. Последовательности нуклеотидов гена env, отвечающие за взаимодействие с клеточными рецепторами, определены и могут быть непосредственно замещены последовательностями, кодирующими лиганды невирусной природы. С использованием этого подхода удалось получить химерные белки оболочки, содержащие последовательности аминокислот, изменяющие тропизм вируса. В частности, слияние эпидермального фактора роста (ЭФР) с белком оболочки амфотропного ретровируса через расщепляемую протеиназой фактора Xa линкерную последовательность аминокислот приводило к взаимодействию вирусов преимущественно с ближайшими клетками, содержащими на своей поверхности рецепторы фактора. После отщепления ЭФР протеиназой вирусные частицы начинали заражать клетки, экспрессирующие гомологичные вирусные рецепторы. Однако необходимо иметь в виду, что специфическое взаимодействие ретровирусов с рецепторами на поверхности клеток-хозяев

740

требует образования контактов между несколькими частями полипептидной цепи белка оболочки и рецептора. Кроме того, белок оболочки ретровирусов не только обеспечивает контакт с рецепторами на поверхности клеток-мишеней, но и участвует в последующих этапах проникновения вируса внутрь клеток – интернализации в составе комплекса с рецептором. Все это затрудняет практическое использование подхода с использованием прямого замещения последовательностей аминокислот белка оболочки новыми последовательностями для эффективного изменения тропизма ретровирусов.

Соединение белка оболочки с новыми лигандами. Первые успехи на этом пути были достигнуты путем создания конъюгатов антител с белком оболочки ретровирусов с последующим соединением таких антител с антителами, специфичными в отношении антигенов поверхности клеток посредством стрептавидина. При данном подходе изменение тропизма ретровирусов было достигнуто при использовании антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости, ЭФР или рецепторам трансферрина, экспрессирующимся на поверхности клеток гепатомы. Однако после интернализации вирусных частиц интеграция вирусного генома в геном зараженных клеток проходила крайне неэффективно. Предполагают, что рецептор в комплексе со связанным с ним агентом после проникновения в клеточный компартмент блокирует доступ вирусного генома к клеточному ядру, поскольку при обычной инфекции он задерживается и деградирует на поверхности клеток.

Второй подход в этой группе методов использует химическое присоединение лактозы к белкам оболочки или десиалирование гликопротеинов оболочки вируса. Оба типа модификации дают возможность модифицированным вирусным частицам специфически взаимодействовать с асиалогликопротеиновыми рецепторами, присутствующими, например на поверхности гепатоцитов. Модифицированные таким способом экотропные вирусы приобретают способность с высокой эффективностью заражать гепатоциты человека.

Псевдотипирование. При использовании этой группы методов упаковка геномной РНК ретровирусов проходит в культивируемых клетках, которые экспрессируют гетерологичный белок оболочки, замещающий обычный вирусный белок в процессе внутриклеточного формирования ретровирусных