Экспрессия генов Патрушев

721

выполняется рибозимами, не обладающими высокой специфичностью по отношению к своим субстратам – донорам и акцепторам аминоацильных групп. Некоторые пептиды могли начать синтезироваться после приобретения рибозимами специфичности в отношении выбора субстратов. Хотя этот громоздкий механизм для образования каждой пептидной связи в синтезируемом пептиде требует собственного рибозима, однако он не кажется абсурдным, так как до сих пор бактерии используют такой принцип для синтеза некоторых своих пептидов (например молекулы грамицидина) с помощью специфического набора ферментов. Активность рибозимов могла быть повышена с помощью коротких РНК, объединяющих субстраты друг с другом. После эволюционного возникновения таких кофакторных РНК требования к специфичности рибозимов, синтезирующих пептиды, будут снижаться, и в конце концов появится истинная пептидилтрансфераза в виде 23S рРНК. Как известно, рРНК функционирует в тесной связи с матрицей мРНК, которая специфически сближает донорные и акцепторные аминоацил-тРНК.

Все рассмотренные аргументы подчеркивают важную, если не исключительную, роль РНК в происхождении жизни на Земле. Большинство современных ферментов являются белками, а все известные рибозимы действуют на РНК-субстраты. Уже одно это показывает, что цепь событий, приведшая к такому повороту развития эволюционных преобразований живых систем, остается до конца не понятой. Лабораторные методы, позволяющие моделировать эволюционирование рибозимов in vitro, дают возможность продолжить экспериментальное исследование глобального вопроса о происхождении жизни.

722

ГЛАВА 10.ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ И РАСТЕНИЯ

Методические достижения генной инженерии микроорганизмов, разрушившие межвидовые барьеры в передаче генов, подготовили благоприятную почву для введения рекомбинантных ДНК в многоклеточные организмы. Действительно, идея введения чужеродных генов в геном многоклеточного организма ничем существенно не отличается от блестяще реализованных идей генетической трансформации бактериальных клеток гетерологичными последовательностями нуклеиновых кислот. Поэтому неудивительно, что с развитием генной инженерии появление трансгенных животных и растений не заставило себя долго ждать.

10.1. Способы получения трансгенных многоклеточных организмов

Многоклеточный организм высших животных и растений является продуктом онтогенетического развития, при котором из одной клетки (зиготы), образовавшейся в результате слияния двух половых клеток родителей (гамет), путем большого числа дроблений образуется вся совокупность высокодифференцированных клеток органов и тканей организма. Поскольку любая соматическая клетка или клетка зародышевого пути, в конечном счете, берет свое начало от двух объединившихся родительских клеток, она, как правило, заключает в себе всю (или большую часть) генетическую информацию родительских организмов. Несмотря на то что эта схема является упрощенной и по мере развития дифференцированного состояния соматических клеток их генетический материал часто претерпевает необратимые перестройки (например эритроциты человека вообще лишены ядер), такая картина подчеркивает преемственность генетического материала в рядах клеточных поколений соматических клеток организмов.

Почти все гены зигот имеют хорошие шансы быть представленными в большинстве соматических клеток организма и принять участие в формировании их генотипа и фенотипа. Предпосылки такого рода привели к мысли о возможности изменения фенотипа многоклеточных организмов путем введения новых рекомбинантных генов в геном зигот, еще не претерпевших дробления в раннем эмбриональном развитии. В случае объединения с

723

геномом зиготы новые гены должны распространиться в ряду клеточных поколений соматических клеток и экспрессироваться в большинстве этих клеток. Поскольку, с известными ограничениями, весь многоклеточный организм можно рассматривать как клон соматических клеток, произошедших от единственной клетки, распространение рекомбинантных генов, введенных в

зиготу, в соматических клетках организма допустимо рассматривать как разновидность молекулярного клонирования последовательностей ДНК.

Такой молекулярно-генетический подход к изменению генотипа и фенотипа многоклеточных организмов был реализован экспериментально в середине 1970-х годов. Заражение мышиных эмбрионов на предимплантационной стадии развития вирусом лейкоза мышей (MuLV) приводило к образованию взрослых особей, содержащих вирусную ДНК, интегрированную в геном как соматических клеток, так и клеток зародышевого пути, и эта ДНК передавалась из поколения в поколение. Гены, искусственно введенные в геном многоклеточных организмов и передающиеся от родителей потомству, получили название трансгенов, процесс такого введения и передачи генов обозначили трансгенозом, а животные или растения, содержащие трансгены в геноме своих клеток, стали называть трансгенными. Развитие техники создания трансгенных животных и растений привело к возникновению нового быстро развивающегося направления молекулярной генетики. Были получены уникальные знания об особенностях экспрессии генов и биосинтезе белков в онтогенезе многоклеточных организмов, а также о возможности изменения фенотипа трансгенных организмов, в том числе и коррекции мутантного фенотипа, и использования трансгенных организмов для решения задач биотехнологии, связанных с биосинтезом рекомбинантных белков.

Для получения трансгенных животных в настоящее время применяют три основных метода. Во всех методах рекомбинантные гены в составе векторных молекул вводятся в клетки эмбрионов на ранних стадиях их развития. Наиболее популярным и эффективным методом является прямая микроинъекция нескольких сотен копий линеаризованных молекул рекомбинантной ДНК в пронуклеусы оплодотворенных яйцеклеток. Для этого мышей-самок скрещивают с самцами-производителями и через 12 ч после спаривания вскрывают их яйцеводы, выделяют оплодотворенные

724

одноклеточные яйца и помещают их в культуральную жидкость. В пронуклеусы оплодотворенных яиц с помощью микроманипулятора вводят очищенную ДНК, и прооперированные яйца пересаживают в яйцеводы псевдобеременных реципиентных самок. Некоторая часть жизнеспособных трансплантированных яиц проходит в организме мышей полный пренатальный цикл развития, после чего развившиеся детеныши рождаются естественным путем или с использованием кесарева сечения. Трансгенных животных идентифицируют в помете гибридизацией по Саузерну высокомолекулярной ДНК тканей хвостов с соответствующими зондами, далее трансгенные животные скрещивают друг с другом для получения чистых линий и анализируют экспрессию трансгенов. Приблизительно у 70% трансгенных мышей экзогенная рекомбинантная ДНК имеется во всех соматических клетках и клетках зародышевого пути. Это свидетельствует о том, что у них интеграция рекомбинантной ДНК в хромосомы прошла до прохождения первого цикла их репликации в оплодотворенной яйцеклетке. У остальных 30% трансгены содержат лишь часть соматических клеток, т.е. они являются мозаиками, причем у некоторых трансгенных животных клетки зародышевого пути становятся дефектными, а сами животные

– бесплодными. Как правило, трансгены стабильно передаются из поколения в поколение без существенных изменений. Однако в ряде случаев отмечены их перестройки, образование делеций и амплификация. Кроме непосредственной микроинъекции в пронуклеусы используют введение рекомбинантной ДНК в цитоплазму или ядра двухклеточных эмбрионов, а также в полость бластоцеля зародышей.

Прямая микроинъекция рекомбинантных генов в клетки высокоэффективна, однако методически сложна и требует дорогостоящего оборудования. Более простым способом доставки чужеродных генов в геном животного-реципиента является использование векторов на основе вирусов. В этом случае эмбрионы на ранней (восьмиклеточной) стадии развития инкубируют в культуральной среде в присутствии фибробластов, в которых образуются рекомбинантные ретровирусы, и после заражения такими вирусами эмбрионы пересаживают псевдобеременным самкам мышей, где они продолжают свое развитие. Кроме простоты одним из преимуществ данного способа введения ДНК является то, что в геном клеток зародышей интегрируется, как правило, одна копия исследуемого гена, фланкированного

725

длинными концевыми повторами вирусной хромосомы, что может способствовать эффективной экспрессии гена. Однако к недостаткам метода следует отнести необходимость проведения дополнительных генноинженерных манипуляций при подготовке ретровирусного вектора, ограниченную емкость вектора (размер вставки – до 10 т.п.о.) и мозаицизм образующихся трансгенных животных, которые состоят из клеток как содержащих, так и не содержащих трансгены.

Наконец, следует упомянуть еще об одном способе введения рекомбинантных генов в клетки зародышевой линии животных, при котором используют плюрипотентные (дифференцирующиеся по разным направлениям) эмбриональные стволовые клетки линий ES и EK, предшественники которых были взяты из бластоцисты зародышей мышей. Рекомбинантные гены вводят в

такие клетки любым из вышеупомянутых способов, а кроме того, электропорацией или другими стандартными методами, применяемыми для доставки генов в культивируемые соматические клетки. При этом вместе с исследуемыми генами возможно введение селектируемых маркеров, которые позволяют проводить отбор клеток, экспрессирующих данные маркеры и, следовательно, гарантированно содержащих сцепленные с ними исследуемые гены. Отобранные таким образом клетки переносят в бластоцисты развивающихся эмбрионов или используют для получения агрегационных химер объединением их с клетками восьмиклеточных эмбрионов с последующей пересадкой эмбрионов псевдобеременным самкам.

10.2. Экспрессия трансгенов

Если трансгены в своем функционировании проявляют тканеспецифичность, то уровень их экспрессии зависит от места интеграции в хромосому. В тех редких случаях, когда экспрессия трансгена полностью отсутствует, это объясняют его интеграцией в гетерохроматиновые участки хромосом, неактивные в отношении транскрипции, или другими эффектами положения. Поскольку уровень экспрессии трансгенов у некоторых трансгенных мышей может превышать таковой у его эндогенного гомолога, делают вывод об отсутствии необходимости в точной локализации гена на хромосоме для его эффективной экспрессии. Тканеспецифический характер экспрессии генов

726

обеспечивают, главным образом, их энхансеры – цис-действующие регуляторные последовательности нуклеотидов, которые располагаются как внутри, так и вне генов на значительном удалении от них (см. рис. I.30). Обнаружены гены, экспрессирующиеся в клетках только одного типа (строгая тканеспецифическая экспрессия), в клетках немногих тканей и в клетках многих или большинства типов (так называемые гены "домашнего хозяйства"). В том случае, если энхансеры обеспечивают абсолютный тканеспецифический характер экспрессии, контекст окружающих трансген последовательностей нуклеотидов хромосомы оказывает влияние на уровень его экспрессии только в клетках одного типа. Если же энхансеры дают возможность функционировать трансгену в клетках разных тканей, то уровень экспрессии будет варьировать в клетках этих тканей даже при интеграции в геном единственной его копии.

Обнаружена слабая корреляция между числом копий трансгенов, тандемно интегрированных в геном животного, и суммарным уровнем их экспрессии. Это указывает на функциональную активность лишь немногих трансгенов из всего кластера их множественных копий.

Таким образом, данные, полученные к настоящему времени, указывают на то, что экспрессия рекомбинантных генов у трансгенных животных в большой степени напоминает таковую, происходящую в природных условиях в гомологичном генетическом окружении. Объединение структурных частей рекомбинантных генов с конкретными регуляторными последовательностями организма-реципиента позволяет получать строго детерминированную, тканеспецифическую экспрессию этих генов в процессе трансгеноза.

10.3. Использование трансгенов у животных

Техника трансгеноза открывает практически безграничные, принципиально новые возможности исследования экспрессии генов. Ниже будут кратко рассмотрены четыре активно развиваемые направления использования трансгенов в фундаментальных и прикладных исследованиях. К ним относятся: а) изучение молекулярных механизмов экспрессии генов; б) исследование механизмов дифференцировки соматических клеток в онтогенезе многоклеточных организмов; в) подходы к изменению физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных; г) моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека. Два

727

последних направления исследований являются фундаментом для современной и будущей генотерапии.

10.3.1.Исследование механизмов экспрессии генов

Как уже упоминалось выше, цис-действующие регуляторные последовательности нуклеотидов обеспечивают тканеспецифический характер экспрессии трансгенов. Этим свойством воспользовались для определения точной локализации таких регуляторных элементов генов. Например, с использованием делеционного картирования был идентифицирован энхансерный элемент гена эластазы-1 крыс. Полный ген эластазы-1 в составе фрагмента ДНК длиной в 7,2 т.п.о. экспрессировался у трансгенных мышей, что указывало на наличие в данном фрагменте ДНК всех последовательностей нуклеотидов, необходимых для функционирования гена. Удаление с помощью делеций 5’-фланкирующих последовательностей нуклеотидов этого гена не влияло на тканеспецифический характер его экспрессии в ацинарных клетках поджелудочной железы мышей (место обычной активации гена) до тех пор, пока не затрагивалась последовательность длиной в 205 п.о., непосредственно прилегающая к 5’-концевой его части (рядом с точкой инициации транскрипции). Делеции, которые оставляли лишь 72 п.о. 5’-фланкирующей последовательности, полностью инактивировали ген, что указывало на расположение регуляторного элемента между нуклеотидами в положениях -205 и -72. Такая последовательность обладала всеми свойствами энхансера и сохраняла активность после перемещения за 3 т.п.о. перед сайтом ее нормальной локализации или встраивания в интрон. При этом для нее была характерна способность активировать гетерологичные промоторы.

Использование таких эффективных, хотя и трудоемких методов иногда является единственным путем идентификации тканеспецифических регуляторных элементов генов. Дело в том, что клетки в культуре тканей часто претерпевают дедифференцировку и утрачивают изначально присущий им тканеспецифический характер экспрессии своих генов, поэтому применение культур тканей вместо трансгенных животных для таких целей проблематично.

Экспрессия трансгенов обнаруживается по появлению соответствующего им белкового продукта или транскрипта, а также по специфическим физиологическим реакциям организмов-реципиентов. Это позволяет

728

использовать трансгеноз для изучения путей и механизмов дифференцировки соматических клеток в биологии развития, а также для изменения физиологической и физической конституции сельскохозяйственных животных, моделирования многих наследственных заболеваний человека и разработки методов их лечения.

10.3.2.Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток

вонтогенезе

Выше рассматривалась возможность применения гибридных токсинов для специфического воздействия на группы соматических клеток, обладающих определенными фенотипическими маркерами. Высокоспецифической элиминации определенных групп дифференцирующихся клеток можно достигнуть с использованием трансгеноза. В этом случае гены каталитических субъединиц токсинов (например A-субъединиц дифтерийного токсина (DT-A) или рицина) с помощью генно-инженерных приемов помещают под контроль регуляторных генетических элементов, обеспечивающих их тканеспецифическую экспрессию в клетках трансгенных экспериментальных животных.

После интеграции таких токсигенов в геном развивающегося эмбриона они передаются от клетки к клетке в рядах клеточных поколений без экспрессии до тех пор, пока клетки не начинают дифференцироваться с образованием регуляторных белков, трансактивирующих регуляторные последовательности токсигенов. С этого момента токсигены активированы, т.е. приобрели способность направлять биосинтез белков-токсинов, которые избирательно поражают дифференцирующиеся клетки. Иными словами, начав дифференцироваться в определенном направлении, соматические клетки совершают самоубийство. Поскольку каталитические субъединицы обладают токсическим эффектом лишь внутри соматических клеток и сами по себе не могут проникнуть в окружающие их клетки извне, их токсический эффект распространяется только на клетки, в которых происходит экспрессия токсигенов.

С помощью такой стратегии были получены впечатляющие результаты при изучении путей терминальной дифференцировки соматических клеток животных in vivo. В частности, были продемонстрированы различия во

729

временнóй активации промоторов генов γ2- и α2-кристаллинов в процессе формирования хрусталиков глаз у мышей, а также последствия активации промоторов гена эластазы-I, специфически функционирующего в ацинарных клетках поджелудочной железы.

Из-за большой токсичности вышеупомянутых белковых токсинов (чтобы убить клетку, достаточно одной молекулы) использование таких токсигенов может сопровождаться артефактами и приводить к ранней гибели трансгенных эмбрионов. Для преодоления этих трудностей были разработаны методы, при которых сам по себе трансген не оказывает токсического действия на клетки, но внутриклеточное присутствие белкового продукта его экспрессии делает клетки чувствительными к определенному экзогенному воздействию.

В одной из таких систем использовали ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk), продукт которого, в отличие от тимидинкиназы клеток-хозяев, обладает способностью фосфорилировать некоторые аналоги нуклеозидов, например ацикловир и FIAU [1-(2-дезокси-2-фтор-β-D- арабинофуранозил)-5-иодоурацил]. После фосфорилирования с помощью HSVtk до нуклеозидмонофосфатов образующиеся аналоги нуклеотидов могут далее фосфорилироваться тимидилаткиназой клеток-хозяев с образованием соответствующих дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и конкурентно блокировать репликацию ДНК соматических клеток. Аналогичный подход был использован для элиминации в эмбриогенезе клеток, экспрессирующих кристаллины, кроветворных клеток (в частности тимоцитов) и в ряде других случаев.

Токсигены находят применение не только для изучения генетики развития, но и для создания животных, моделирующих наследственные и приобретенные заболевания человека.

10.3.3.Изменение физиологического статуса лабораторных и

сельскохозяйственных животных

Одними из первых указаний на возможность использования трансгеноза для изменения физиологических параметров и физической конституции организма животных были результаты работ по экспрессии трансгенов гормонов, контролирующих рост млекопитающих: рилизинг-фактора гормона

730

роста (GRF), соматостатина и самого гормона роста (growth hormone, GH). Гормон роста индуцирует образование в печени инсулиноподобного фактора роста I (IGF-I), который, в свою очередь, ускоряет пролиферацию клеток. Повышенное внутриклеточное содержание GH крысы, быка или человека в клетках трансгенных мышей сопровождалось ускорением их роста через три недели после рождения, рост стабилизировался через 12 недель, когда размер мышей в два раза превышал обычный. К аналогичному эффекту приводила экспрессия у трансгенных мышей гена GRF человека, находящегося под контролем промотора гена металлотионеина, который стимулировал эндогенное образование GH, что сопровождалось повышением внутриклеточного уровня IGF-I-мРНК и ускорением роста трансгенных животных.

Увеличение уровня экспрессии GH у трансгенных мышей обусловливает и ряд других физиологических реакций организма. Например, под действием трансгена GH отмечены ингибирование биосинтеза эндогенного GH и дегенерация соматотропных клеток гипофиза, в норме продуцирующих этот гормон. Экспрессия приводила, кроме того, к изменению половых различий в строении печени, ослаблению фертильности самок и преждевременному старению трансгенных животных.

Результаты таких опытов легли в основу целого направления прикладных исследований, в которых были предприняты попытки изменения физиологического статуса сельскохозяйственных животных путем гормональных воздействий, опосредованных трансгенами. Были получены трансгенные овцы и свиньи, однако результаты оказались не вполне удовлетворительными из-за вышеупомянутых побочных эффектов GH. Решение этой проблемы, по-видимому, лежит на пути создания трансгенных животных с регулируемой экспрессией трансгенов. М. Мак-Грейну с соавторами недавно удалось получить гигантских мышей с помощью трансгена GH быков, экспрессирующегося под контролем регуляторной области крысиного гена З- энолпируваткарбоксикиназы, для которого характерна тканеспецифическая экспрессия в печени и почках. Авторам удалось управлять экспрессией трансгена путем изменения содержания углеводов и белков в пищевом рационе мышей. Такой же подход был успешно применен для получения полноценных трансгенных свиней, которые характеризовались ускоренным