Экспрессия генов Патрушев

551

следующем (рис. II.4). Реакционная смесь обычно содержит исследуемую ДНК, dATP, dCTP, dGTP и TTP, Taq-полимеразу и два синтетических олигодезоксирибонуклеотидных праймера длиной 15–30 нуклеотидов, комплементарных участкам противоположных цепей ДНК, фланкирующих исследуемый участок ДНК-матрицы. ПЦР начинается с кратковременного (1–2 мин) прогревания реакционной смеси при 95o, в процессе которого происходит плавление цепей матричной ДНК и инактивация примесных белков, которые могут присутствовать в реакционной смеси, если используется недостаточно очищенная матричная ДНК, например из клинических образцов. Далее реакционную смесь охлаждают до температуры отжига праймеров с матричной ДНК (37–65o). В результате праймеры связываются с комплементарными им местами на матрице и с этого момента начинают служить затравками для синтеза Taq-полимеразой новых цепей ДНК, комплементарных каждой из цепей денатурированной матричной ДНК. Для проведения синтеза ДНК в оптимальных для Taq-полимеразы условиях температуру реакционной смеси поднимают до 72o и при такой температуре проводят элонгацию цепей вновь синтезирующейся ДНК в течение 0,5–2 мин. По окончании стадии синтеза ДНК заканчивается первый цикл ПЦР, после чего проводятся такие же второй, третий и т.д. в автоматическом режиме. По окончании третьего цикла уже образуется дискретный продукт ПЦР – фрагмент двухцепочечной ДНК, содержащий на своих 5’-концах последовательности нуклеотидов праймеров. Количество продукта ПЦР в реакционной смеси после завершения каждого цикла удваивается и, следовательно, по мере прохождения реакции экспоненциально возрастает, достигая нескольких микрограммов в реакционной смеси объемом 25–50 мкл. По окончании ПЦР содержимое реакционной смеси анализируют электрофорезом в агарозном геле в присутствии бромистого этидия, где продукт реакции выявляется в УФ-свете. Продукт ПЦР можно выделить из агарозного геля в чистом виде и работать с ним, как с обычным фрагментом двухцепочечной ДНК, т.е. гидролизовать рестриктазами, клонировать в плазмидных векторах по "липким" и "тупым" концам, секвенировать или использовать в качестве зондов при гибридизации.

С помощью ПЦР можно амплифицировать in vitro сегменты ДНК длиной от 0,1 до 5–7 т.п.о. и более, а для получения положительного результата достаточно присутствия в реакционной смеси одной–двух копий

552

амплифицируемой последовательности нуклеотидов (например геномной ДНК, содержащейся в одной–двух соматических клетках). При этом не возникает необходимости в тщательной очистке матрицы, так как большинство попадающих в реакционную смесь белков и ферментов инактивируется в первых же циклах ПЦР и не оказывает влияния на протекание реакции при высоких температурах. Благодаря таким особенностям, как простота постановки, высокая чувствительность и воспроизводимость, ПЦР в последнее время получила широкое распространение в фундаментальных и прикладных исследованиях по молекулярной биологии и генетике. Возможность амплификации любого сегмента ДНК, последовательность нуклеотидов которого известна, и получение его по завершении ПЦР в гомогенном виде и препаративном количестве делают ПЦР альтернативным методом молекулярного клонирования коротких фрагментов ДНК. При этом не возникает необходимости в применении тех сложных методических приемов, которые используют в генной инженерии при обычном клонировании.

Рис. II.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

553

Поскольку специфичность ПЦР зависит главным образом от соответствия последовательности нуклеотидов праймеров первичной структуре амплифицируемых фрагментов ДНК, эта специфичность приближается к абсолютной при повышении длины праймеров до 17–20 нуклеотидов. Такая высокая специфичность и чувствительность позволяют использовать ПЦР для ДНК-диагностики инфекционных и наследственных заболеваний человека, а также вирусоносительства в тех случаях, когда вирусом в латентной форме заражены лишь отдельные соматические клетки, например в случае вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (см. главу 11). Разработка метода ПЦР во многом расширила методические возможности молекулярной генетики, и в частности генной инженерии, причем настолько, что это кардинально изменило и усилило исследовательский потенциал многих ее направлений.

Точность амплификации ДНК термостабильными ДНК-полимеразами является особенно критическим параметром в том случае, если продукты ПЦР используются далее для конструирования экспрессирующихся генов. Необходимость в уменьшении частоты мутаций стимулирует поиски новых термостабильных ДНК-полимераз, амплифицирующих ДНК с большей точностью. В табл. II.2 приведены результаты испытаний точности синтеза ДНК различными коммерческими ДНК-полимеразами.

Относительно высокая точность синтеза ДНК in vitro ДНК-полимеразами Pfu и Vent обусловлена наличием у них 3’-5’-экзонуклеазной корректирующей активности. Частота ошибочно включенных нуклеотидов в результате одновременного функционирования двух разных ДНК-полимераз в смесях, применяемых для амплификации длинных сегментов ДНК (long PCR), оказывается ниже, чем при использовании Taq-полимеразы, но выше, чем для очищенной ДНК-полимеразы Pfu.

При проведении аллель-специфической ПЦР (см. раздел 11.1) необходимо учитывать способность Taq-полимеразы инициировать синтез ДНК на праймерах, 3’-концевой нуклеотид которых некомплементарен матричной ДНК. При исследовании этого вопроса оказалось, что не все пары

554

Таблица II.2

Частота ошибок при синтезе ДНК, осуществляемом термостабильными ДНК-полимеразами in vitro при проведении ПЦР в оптимальных условиях

555

ошибочно спаренных нуклеотидов праймера и ДНК-матрицы одинаково эффективно предотвращают синтез ДНК Taq-полимеразой. По способности направлять синтез ДНК все такие пары 3’-концевого нуклеотида праймера и соответствующего нуклеотида матричной ДНК располагаются в следующий ряд: C–C, A–G, G–A, G–G < A–A < T–C, C–T, T–T << A–C, C–A << G–T, T–G (данные фирмы "Cetus"). При этом наименее благоприятными для продолжения синтеза ДНК являются пары нуклеотидов пурин–пурин и пиримидин– пиримидин.

РНК-зависимые ДНК-полимеразы (обратные транскриптазы,

ревертазы). Обратные транскриптазы способны осуществлять синтез ДНК на матрице РНК, полимеризуя четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата, как это имеет место в случае ДНК-зависимых ДНК-полимераз. Обратные транскриптазы, так же как и ДНК-полимеразы функционируют только при наличии затравки. Широко используемая в генной инженерии обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц помимо полимеризующей активности обладает 5’→3’- и 3’→5’-экзорибонуклеазными активностями и расщепляет РНК в ДНК-РНК-гибридах по процессивному механизму. Обратные транскриптазы находят применение в синтезе двухцепочечных ДНК, комплементарных РНК (особенно мРНК), для последующего ее клонирования в плазмидных векторах при получении библиотек (клонотек) кДНК (см. раздел 7.3). Обратные транскриптазы, подобно ДНК-полимеразам, могут быть использованы для введения радиоактивной или флуоресцентной метки в ДНКзонды в составе соответствующим образом меченных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

Недавно способность синтезировать ДНК на матрице РНК в определенных условиях была продемонстрирована для термостабильной ДНКполимеразы Thermus thermophilus. Это позволяет использовать ее для прямого обнаружения специфических РНК в биологических образцах методом ПЦР. Современные модификации такого подхода дают возможность в одной реакционной смеси (и пробирке) синтезировать в реакции обратной транскрипции небольшое число копий амплифицируемого фрагмента ДНК на матрице РНК, которые сразу же используются тем же ферментом в качестве матрицы в обычной ПЦР (one tube PCR).

556

7.1.4. Другие ферменты

Среди других многочисленных ферментов, используемых в генной инженерии, прежде всего следует упомянуть полинуклеотидкиназы, которые осуществляют перенос γ-фосфатных групп ATP на 5’-OH группы ДНК или РНК.

Полинуклеотидкиназа бактериофага Т4 широко используется для введения радиоактивной метки в ДНК или РНК с целью получения радиоактивно меченных зондов или секвенирования нуклеиновых кислот.

Терминальная трансфераза из тимуса теленка (терминальная дезоксирибонуклеотидилтрансфераза), осуществляющая последовательное присоединение дезоксирибонуклеозидмонофосфатов из пула дезоксирибонуклеозидтрифосфатов к 3’-OH-группам молекул ДНК, используется для введения радиоактивной метки в составе меченых нуклеотидов в 3’-концы ДНК, а также присоединения к 3’-концам фрагментов ДНК (особенно кДНК) протяженных гомополимерных последовательностей нуклеотидов (коннекторов) для последующего их клонирования.

Щелочные фосфатазы бактерий (BAP) и кишечника теленка (CIAP) катализируют удаление 5’-фосфатных групп ДНК или РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Их используют при подготовке фрагментов нуклеиновых кислот к введению 5’-концевой радиоактивной метки 32Р, а также для предотвращения лигирования векторных молекул ДНК самих на себя. Как уже упоминалось выше, ДНК-лигаза способна образовывать фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах лишь при наличии в них 5'-концевого фосфата. Удаление 5'-концевых фосфатных групп молекул вектора, лианеризованных с помощью одной рестриктазы во время его подготовки для клонирования соответствующего фрагмента ДНК, предотвращает образование кольцевых молекул вектора (без вставки), а также его олигомеров во время лигирования с клонируемой последовательностью. Необходимые для лигирования со вставкой фосфатные группы содержатся в самих клонируемых фрагментах ДНК, а остающиеся в результате неполного лигирования два одноцепочечных разрыва репарируются in vivo после введения вектора со вставкой в бактериальные клетки.

В заключение следует рассмотреть некоторые нуклеазы, часто

557

используемые в генной инженерии. Нуклеазы – это гидролитические ферменты, расщепляющие нуклеиновые кислоты. По механизму расщепления субстратов нуклеазы разделяют на экзо- и эндонуклеазы. Экзонуклеазы осуществляют последовательное отщепление моноили небольших олигонуклеотидов с концов молекул ДНК или РНК, тогда как эндонуклеазы вносят в молекулы нуклеиновых кислот внутренние разрывы. В частности, к эндонуклеазам относятся многочисленные рестриктазы, рассмотренные выше. Некоторые нуклеазы обладают более широкой специфичностью и могут гидролизовать как РНК, так и ДНК, а также одновременно проявлять эндо- и экзонуклеазную активности. Нуклеаза Bal31 из Alteramonias aspejiana последовательно отщепляет отдельные моно- и олигонуклеотиды с 5’- и 3’-концов двухцепочечных ДНК, укорачивая обе цепи ДНК приблизительно с равной скоростью. При этом нуклеаза Bal31 гидролизует и одноцепочечные ДНК.

Экзонуклеаза III E. coli катализирует последовательное отщепление 5’- нуклеотидов из двухцепочечных ДНК в направлении 3’→5’. Фермент обладает эндонуклеазной активностью по отношению к апуринизированной ДНК, активностью РНКазы H (гидролиз РНК в РНК-ДНК-гибридах) и 3’-фосфатазной активностью.

Экзонуклеаза фага λ катализирует последовательное отщепление 5’- мононуклеотидов в двухцепочечных ДНК при наличии в них 5’-концевых фосфатных групп. Ее используют для получения одноцепочечных молекул ДНК с целью их последующего секвенирования.

Нуклеаза S1 из Aspergillus orizae специфически расщепляет одноцепочечные молекулы ДНК с образованием 5’-фосфорилированных моно- и олигонуклеотидов. Те же свойства присущи и нуклеазе золотистой фасоли

(mung bean).

Панкреатическая рибонуклеаза A (РНКаза A) обладает активностью эндорибонуклеазы, специфически расщепляющей фосфодиэфирные связи, образованные пиримидиновыми нуклеотидами. Продуктами гидролиза являются 3’-фосфорилированные пиримидиновые мононуклеотиды и олигонуклеотиды, содержащие концевые пиримидин-3’-монофосфаты.

Панкреатическая дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) представляет собой эндонуклеазу, гидролизующую как одно-, так и двухцепочечную ДНК с образованием сложной смеси моно- и олигонуклеотидов, содержащих 5’-

558

фосфатные группы. В присутствии ионов Mg2+ ДНКаза I независимо атакует каждую цепь ДНК, при этом места разрывов располагаются статистически вдоль молекулы, а в присутствии ионов Mn2+ расщепляет обе цепи ДНК приблизительно напротив друг друга.

Рассмотренные ферменты не исчерпывают всего списка белков, используемых в генной инженерии. Особенности применения многих из этих ферментов для решения конкретных генно-инженерных задач будут не раз обсуждаться при дальнейшем изложении принципов генной инженерии.

7.2. Векторы

Ферменты, описанные в предыдущем разделе, позволяют производить тонкие манипуляции как с протяженными молекулами ДНК, так и с их фрагментами. В частности, с помощью рестриктаз можно с большой точностью разрезать молекулы ДНК, а образовавшиеся в результате фрагменты соединять в любой желаемой последовательности друг с другом, восстанавливая сахаро-фосфатный остов молекулы ДНК с помощью ДНКлигазы. Однако с использованием только этих ферментов еще нельзя решить одну из основных методических задач молекулярной генетики – выделение любой требуемой нуклеотидной последовательности в чистом виде и в количестве, достаточном для исследования этих последовательностей биохимическими методами. Исключение составляет метод ПЦР, однако его применение ограничивается короткими последовательностями нуклеотидов.

Основная идея, позволяющая решать эту задачу, заключается в том, чтобы присоединить исследуемые фрагменты ДНК к молекуле-переносчику, которая могла бы автономно существовать внутри бактериальных или эукариотических клеток в виде одной или нескольких копий и передаваться вместе со встроенным в нее фрагментом ДНК от одной клетки к другой. Такие молекулы-переносчики фрагментов нуклеиновых кислот были созданы, их называют векторами, и они являются одним из важнейших инструментов генной инженерии.

Идеальная векторная молекула должна обладать несколькими обязательными свойствами. Во-первых, любой вектор должен длительное время существовать в популяции клеток-хозяев, т.е. реплицироваться автономно или вместе с хромосомами клеток. Во-вторых, в любом векторе

560

Обозначены положения уникальных сайтов рестрикции, а также функционально значимых генов

а – векторная плазмида pBR322; б – экспрессирующая векторная плазмида pUC18; в – векторная плазмида πAN7, предназначенная для отбора рекомбинантных клонов с использованием гомологичной рекомбинации; г – многофункциональная векторная плазмида Bluescript

Первые эффективные векторы для клонирования фрагментов чужеродной ДНК, не утратившие своего значения и поныне, были получены с использованием бактериальных плазмид. Большая серия векторных плазмид, обозначенных символом pBR, создана на основе репликона природной плазмиды ColEI, придающей клеткам E. coli устойчивость к колицину путем его объединения с генами устойчивости к антибиотикам. Таким образом, бактериальные клетки, несущие подобные комбинированные плазмиды, приобретали устойчивость к соответствующим антибиотикам, и их было легко отличить от бесплазмидных клеток путем простого посева на питательную среду с антибиотиками. Генетическая карта одного широко распространенного вектора этой серии – pBR322 изображена на рис. II.5,а. Такая плазмида представляет собой кольцевую ковалентно замкнутую молекулу ДНК длиной 4363 п.о. Последовательность нуклеотидов pBR322 полностью известна. Плазмида содержит гены устойчивости к тетрациклину (Tc) и ампициллину (Ap), которые были перенесены в плазмиду pBR322 из плазмиды pSC101 и транспозона Tn3 соответственно. Оба этих гена являются селектируемыми генетическими маркерами плазмиды, т.е. позволяют проводить отбор бактериальных клеток с плазмидой pBR322 по их способности к росту на питательных средах в присутствии тетрациклина и(или) ампициллина. Плазмида pBR322 содержит также обеспечивающий ее стабильную репликацию в клетках E. coli участок ДНК, который включает область начала репликации (ori). Характерной чертой плазмиды pBR322, как и любого современного вектора, является наличие в ней нескольких уникальных сайтов рестрикции, обозначенных на генетической карте. Следует иметь в виду, что встраивание в плазмиду клонируемых чужеродных фрагментов ДНК по сайтам рестрикции, расположенным в генах Ар или Tc (например PstI или BamHI), будет нарушать целостность этих генов и их функциональную активность. В результате происходит утрата бактериальными клетками, содержащими рекомбинантные плазмиды, устойчивости к соответствующим антибиотикам. По