Экспрессия генов Патрушев

501

декомпактизуется еще сильнее в условиях максимальной транскрипции, когда молекулы РНК-полимеразы движутся вдоль ДНК одна за другой на небольшом расстоянии друг от друга, как это имеет место, например в кольцах Бальбиани. Уровень упаковки ДНК в хроматине метафазных хромосом самый высокий: исходная длина ДНК в этом случае уменьшается в 6000–7000 раз.

Следует подчеркнуть, что компактизация ДНК вдоль хроматид в интерфазных политенных хромосомах высоко упорядочена в индивидуальных хромосомах генома и обладает абсолютной видовой специфичностью. Это позволяет использовать рисунок поперечной исчерченности индивидуальных политенных хромосом для их идентификации и физического картирования генов. В настоящее время установлено, что некоторые большие гены Drosophila (например ген dunce, кодирующий фосфодиэстеразу циклического АМР, а также гены E74 и Shaker) локализованы в нескольких дисках и междисках и, следовательно, неравномерно компактизованы по своей длине. Различные уровни упаковки ДНК наблюдают в разных районах одних и тех же политенных хромосом, и для этих уровней, по-видимому, характерны более тонкие градации, чем те, которые выявляются при визуальных наблюдениях в виде поперечной исчерченности политенных хромосом.

503

а – мутагены, образующиеся вне микрокомпартмента, содержащего ДНК (слева) и внутри него (справа); б – гипотетический ген в виде "розетки" с интронами в виде петель, окружающих объединенные экзоны. Слева – структура гена с расправленными петлями, справа – их гипотетическая реальная пространственная структура, образующая защитную оболочку вокруг экзонов; в – расположение известных жизненно важных генов на хромосоме 2 без предварительной обработки исходных данных (1), а также после обработки с учетом кластеров и гипотетических летальных генов (2). Гены, расстояние между которыми <10 т.п.о., объединяли в кластеры (подчеркнуты), которые на графике 2 изображали в виде отдельных точек с доверительными интервалами, лежащими между первым и последним нуклеотидами кластера. По мере необходимости вводили гипотетические гены (пропуски между точками на графике 2). Указаны коэффициент детерминированности R2, описывающий точность аппроксимации полученных данных к линейной функции, и ее уравнение

У большинства хромосом соматических клеток эукариот не происходит политенизации ДНК, и соответствующая часть геномной ДНК заключена в одной хроматиде. Тем не менее, несмотря на то что в интерфазных ядрах большинства соматических клеток визуально не выявляется четкая хромомерная структура индивидуальных хромосом, нет основания полагать, что их хроматиды организованы принципиально иначе, чем в политенных хромосомах. Действительно, у всех метафазных хромосом соматических клеток животных после их гистохимической окраски выявляется высокоспецифичная поперечная исчерченность (бэндинг), и этот рисунок может быть следствием компактизации высокоупорядоченных хромомерных структур, исходно присутствующих в интерфазных хромосомах. Если такое предположение верно, то у любых интерфазных хромосом соматических клеток эукариот расположение хромомеров вдоль хроматид, а, следовательно, и уровни компактизации ДНК видоспецифичны и являются постоянной характеристикой индивидуальных хромосом и биологических видов в целом.

Рассматривая индивидуальную интерфазную хромосому как потенциальную мишень для мутагенов, можно заключить, что защищенность генетической информации ее индивидуальных локусов от их действия будет прямо пропорциональна уровням компактизации заключенной в них ДНК, т.е. концентрации последовательностей нуклеотидов на единицу ядерного объема, занимаемого этими участками генома. Рассмотрим подробнее процессы, которые могут происходить в микрокомпартментах (отдельных хромомерах) хромосом при их контакте с химическими внутриядерными мутагенами

504

(рис. I.64,а). Как и в случае целых ядер эукариотических клеток, химические мутагены поступают в микрокомпартменты двумя различными путями: образуясь непосредственно внутри них, например под действием ионизирующего излучения, и путем радиальной диффузии через поверхность микрокомпартментов (индивидуальных хромомеров). В первом случае частота мутаций, возникающих на участке заключенной в микрокомпартмент хромосомной ДНК в результате контактов с образующимися здесь же химическими мутагенами, будет обратно пропорциональна концентрации этой ДНК в микрокомпартменте, т.е. уровню ее компактизации в хромомере. Действительно, в продуктивных (приводящих к мутациям) взаимодействиях нуклеотидов ДНК с мутагенами участвует доля нуклеотидов ДНК, пропорциональная количеству нуклеотидов, контактирующих c мутагенами. Эта доля уменьшается при увеличении концентрации нуклеотидов-акцепторов мутагенов в микрокомпартменте. При условии взаимодействия всех k мутагенов с K нуклеотидами рассматриваемого микрокомпартмента (с последующим образованием аддуктов нуклеотид-мутаген и мутаций) частота мутаций F на данном участке ДНК будет равна:

F = Kk .

В более общем виде это выражение можно записать, как:

где a – коэффициент эффективности взаимодействия мутагенов с нуклеотидами-акцепторами (0 < a ≤ 1). Если количество нуклеотидов и молекул мутагенов в индивидуальном микрокомпартменте выразить через их концентрации в нем (соответственно C и c), то выражение (4) примет вид:

F = acC ,

поскольку по определению k = cV, а K = CV (V – объем микрокомпартмента, занимаемого индивидуальным хромомером).

Если предположить, что стационарная концентрация мутагенов, образующихся внутри интерфазного ядра эукариотических клеток, одинакова во всех его частях, то частота мутаций, вызываемых такими агентами в индивидуальных хромомерах эукариотических хромосом, будет обратно

505

пропорциональна концентрации нуклеотидов ДНК этих хромомеров в соответствующих микрокомпартментах, т.е. обратно пропорциональна плотности упаковки ДНК в хромомере. Следовательно, локальная плотность упаковки цепей ДНК в интерфазном ядре эукариотических клеток может быть важным фактором, определяющим частоту мутаций в соответствующих генетических локусах. При этом необходимо учитывать, что белки являются неотъемлемой частью хроматина эукариотических клеток, и они также могут оказывать влияние на частоту мутаций в индивидуальных хромомерах, затрудняя доступ мутагенов к нуклеотидам ДНК.

Судьба мутагенов, поступающих в ядро эукариотической клетки из цитоплазмы в результате радиальной диффузии, складывается иначе (см. рис. I.64,а, слева). По-видимому, значительная их часть взаимодействует с нуклеотидами ДНК, расположенной на периферии ядра или внутриядерных хромомеров, и степень защиты как ядра в целом, так и его отдельных микрокомпартментов прямо зависит от плотности такой защитной оболочки. Вторым фактором, регулирующим глубину проникновения мутагенов в ядро и его микрокомпартменты, является реакционноспособность самих мутагенов. Данный параметр, ранее обозначенный как коэффициент эффективности взаимодействия мутагенов с нуклеотидами a (уравнение (4)), определяет время жизни мутагена в ядре, т.е. как скоро молекула мутагена прореагирует с потенциальными нуклеотидами-акцепторами, которые мутаген встречает в процессе диффузии внутри ядра. Третьим фактором, от которого зависит эффективность защиты кодирующих жизненно важных последовательностей нуклеотидов генома от мутаций, вызываемых такими мутагенами, является пространственное расположение самих внутриядерных последовательностей. Очевидно, что вероятность встречи с мутагенами и взаимодействия с ними больше у нуклеотидов последовательностей, локализованных на периферии ядра или хроматиновых доменов – хромомеров. С учетом этого фактора можно полагать, что максимальная защита имела бы место в том случае, если бы мутагены первыми встречали избыточные некодирующие последовательности, мутации в которых нейтральны в отношении влияния на жизнеспособность клеток многоклеточного эукариотического организма.

В последнее время появляется все больше экспериментальных данных, свидетельствующих о высокоупорядоченном распределении специфических

506

последовательностей нуклеотидов в интерфазных ядрах эукариот. Одна группа данных такого рода, связанных с упорядоченной конденсацией нитей ДНК вдоль хроматид индивидуальных интерфазных хромосом, была уже обсуждена выше. Помимо этого, активно рассматривается модель петельно-доменной организации генов в эукариотических хромосомах. Неслучайное распределение MAR- и SAR-последовательностей в геномной ДНК эукариот и их ассоциация с белками ядерного матрикса (скэффолда) в интерфазе клеточного цикла, повидимому, весьма специфически контролируют пространственное расположение протяженных участков интерфазных хромосом в ядрах. Кроме того, на более низком (хромомерном) уровне компактизации интерфазных хромосом также обнаружены специфические способы укладки ДНК в виде больших и малых петель, вероятно, относящихся к хромомерам и "розеткам" соответственно (см. рис. I.64,б). Не исключена возможность, что в соответствии с моделью Н.А. Резника и соавторов (1991 г.) образование розеток из ДНПпетель специфически отражает интрон-экзонную структуру конкретных генов. Если такая модель соответствует действительности, то петли интронов генов, заключенных в розетки, могут создавать специфическую защитную оболочку, предохраняющую экзоны генов от контакта с мутагенами. В этой связи соотношение суммарных размеров интронов и экзонов индивидуальных генов может оказаться существенным параметром, характеризующим уровень защищенности функционально значимых участков генов от химического мутагенеза. Чем больше отношение суммарной длины интронов к суммарной длине экзонов в конкретном гене, тем более плотную защитную оболочку интроны могли бы сформировать вокруг компактизованных экзонов. Такое соотношение может указывать на уровень защищенности конкретных генов (или даже их частей) от химических мутагенов.

Описанные выше структурные особенности организации генетического материала позволяют предполагать разную и генетически детерминированную доступность индивидуальных участков интерфазных хромосом для химических мутагенов. Имеются, по крайней мере, три группы экспериментальных данных, указывающих на то, что различные участки одного и того же генома спонтанно изменяются с помощью мутаций с разной скоростью. Прежде всего, это прямые экспериментальные указания на неодинаковую мутабильность как различных генов одного и того же генотипа, так и одного и того же гена в генотипах разных

507

биологических видов.

При другом подходе к исследованию этой проблемы путем компьютерного анализа баз данных последовательностей нуклеотидов было установлено, что степень эволюционной дивергированности конкретных участков генома у разных видов млекопитающих непостоянна и может изменяться от локуса к локусу. Скорость накопления замен нуклеотидов в конкретных локусах приблизительно одинакова как для кодирующих последовательностей нуклеотидов генов (экзонов), так и для соседствующих с ними некодирующих последовательностей, казалось бы, не подверженных давлению отбора. Этот, на первый взгляд, странный результат вполне естественно объясняется в рамках предлагаемой модели дифференциальной защиты различных хромосомных локусов от спонтанных мутаций как следствие упорядоченного гетерогенного распределения геномной ДНК внутри интерфазных ядер. Действительно, рядом расположенные последовательности должны быть одинаково защищены от мутагенов независимо от их функциональной нагрузки. Такой механизм защиты конкретных генетических локусов от спонтанных и индуцированных мутаций мог бы приводить к мозаичной эволюции генома, предполагаемой в модели Б.Ф.Купа.

Наличие в геноме филогенетически консервативных последовательностей нуклеотидов, как правило, принято объяснять жестким давлением отбора на эти последовательности в процессе эволюции. Например, к числу наиболее консервативных из известных белков относятся гистоны H3 и H4, у которых одна замена на 100 аминокислотных остатков, по-видимому, эволюционно фиксируется в полипептидной цепи не чаще чем в несколько сотен миллионов лет. На противоположном полюсе находятся иммуноглобулины и фибринопептиды, у которых такие мутационные изменения фиксируются в геноме в сотни раз быстрее. В соответствии с традиционной точкой зрения медленно и быстро эволюционирующие белки различаются по содержанию в них функционально значимых сайтов, изменение которых под действием мутаций несовместимо с жизнью. Можно предполагать, однако, что селективная консервативность их генов обеспечивается и структурными особенностями соответствующих локусов генома конкретных видов организмов. Функционирование такого механизма предотвращало бы тяжелые последствия в виде летальных исходов, которыми приходится расплачиваться организмам и

508

соматическим клеткам за мутации в соответствующих локусах, если бы те возникали с такой же частотой, что и в функционально незначимых частях генома. Подобный механизм мог бы быть эффективным в селективной защите от мутаций генетических локусов, содержащих множественные копии генов, так как избыточность генетической информации создает особенно благоприятную почву для дивергенции гомологичных последовательностей. Действительно, дупликации генов и их последующая дивергенция рассматриваются в настоящее время как ключевые механизмы эволюционного процесса.

Еще одна группа данных, свидетельствующих в пользу модели дифференциальной защиты отдельных генетических локусов от спонтанных мутаций, была получена при анализе скоростей образования мутаций в трансгенах, интегрированных в различные участки генома организма-хозяина. Значительную вариабельность в скоростях мутирования локусов мини- и микросателлитов, обнаруженную в геноме млекопитающих и проявляющуюся в различиях уровней их внутрипопуляционного полиморфизма, также частично можно объяснить с помощью обсуждаемой модели.

Таким образом, видоспецифическое пространственное расположение ДНК отдельных генетических локусов интерфазных хромосом создает материальную основу для их дифференциальной чувствительности по отношению к химическим мутагенам экзогенного и эндогенного происхождения. Избирательная доступность индивидуальных нуклеотидов ДНК таких локусов может детерминировать относительную частоту спонтанных мутаций в отдельных локусах геномной ДНК эукариот. Все это может иметь большое значение для онтогенетического и филогенетического развития биологических видов.

5.3.4. Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах

Если гипотеза о наличии внутри ядер генетически детерминированных, пространственно упорядоченных участков геномной ДНК является верной, то это влечет за собой важное следствие. В этом случае в процессе эволюционных преобразований геномов их участки, максимально защищенные от действия химических мутагенов, в результате транслокаций и других хромосомных перестроек могли быть заняты генами, функциональная целостность которых особенно важна для выживания клеток или организмов.

509

Такими генами являются, прежде всего, жизненно важные (летальные) гены, инактивация которых под действием мутаций приводит к гибели клеток. Действительно, организмы, у которых критические гены максимально защищены от действия мутагенов, должны были бы обладать эволюционным преимуществом перед организмами, геном которых не обладает этими свойствами, и в первую очередь сохраняться естественным отбором. Если это так, то летальные гены маркируют в геноме современных организмов участки, максимально благоприятные для их целостности, т.е. наиболее защищенные от действия мутагенов, наиболее доступные для белков системы репарации и т.п. В этой связи можно предполагать, что линейное расположение жизненно важных генов вдоль ДНК отражает особенности пространственной организации ДНК в ядрах эукариот на высшем уровне.

Используя эти рассуждения в качестве рабочей гипотезы, мы исследовали расположение жизненно важных генов на всех 16 хромосомах дрожжей Saccharomyces cerevisiae, первичная структура которых в настоящее время полностью определена. Для этого объекта точно известно положение на хромосомах многих жизненно важных генов. В ходе исследований было установлено, что на всех хромосомах дрожжей имеются участки, в которых известные на момент исследования летальные гены (или их кластеры) расположены периодически (на равном расстоянии друг от друга). В качестве примера рассмотрим положение жизненно важных генов на одной из хромосом.

Хромосома 2 является одной из пяти наиболее крупных хромосом дрожжей, длина которой составляет ~813 т.п.о. Хромосома содержит 429 открытых рамок считывания (ОРС), среди которых ко времени проведения анализа 57 были определены как жизненно важные гены, 193 – как нелетальные, а указанные свойства остальных 179 ОРС в настоящее время неизвестны. Следовательно, количество известных нежизненно важных генов хромосомы 2 приблизительно в 3 раза превышает число известных жизненно важных, и это соотношение к настоящему времени соблюдается у всех хромосом дрожжей.

Летальные гены расположены на хромосоме неравномерно. Имеются места их скопления, особенно ярко выраженные в центральной части хромосомы, а также участки, в которых они встречаются не так часто (см. рис. I.64,в,1). Даже без предварительной обработки данных можно было видеть

510

дискретность расположения летальных генов и их кластеров, в которые объединяли гены, если расстояние между ними было меньше 10 т.п.о. (подчеркнуты на рисунке). После представления каждой группы генов отдельного кластера в виде одной точки (с доверительными интервалами, расположенными между началами и концами кластеров) и введения в график нескольких свободных мест для гипотетических, пока неизвестных генов (или их кластеров) периодический характер распределения кластеров летальных генов на хромосоме 2 становится очевидным (см. рис. I.64,в,2). Видно, что места предпочтительного расположения летальных генов или их кластеров расположены на хромосоме 2 периодически. При этом период расположения генов или их кластеров (повторяющееся равное расстояние между следующими друг за другом генами) численно равен выраженному в парах оснований угловому коэффициенту линейной функции, которая описывает последовательность координат генов на графиках.

Таким образом, после минимальных преобразований исходных данных, потребовавших введения в общей сложности девяти гипотетических генов или их кластеров (места, в которых отсутствуют точки на графике), а также выделения 14 групп кластеров генов, последовательность координат летальных генов и их кластеров удовлетворительно описывается линейной функцией с угловым коэффициентом 18 807 (R2 = 0,9992). Это указывает на периодический характер расположения летальных генов вдоль всей хромосомы 2 с периодом ~18,8 т.п.о.

Разработанная нами методика анализа летальных генов, кратко рассмотренная на примере хромосомы 2, была использована для исследования остальных хромосом S. cerevisiae. Оказалось, что на каждой из исследованных хромосом можно выделить участки с периодическим расположением летальных генов. По характеру распределения жизненно важных генов исследованные хромосомы разделяются на две группы. В одной из них (хромосомы 1, 2, 5–7, 9, 11, 12 и 16) летальные гены (и их кластеры) образуют непрерывную последовательность и распределены равномерно по всей длине хромосом. При этом у семи из девяти хромосом этой группы периоды расположения генов очень близки и лежат в пределах 22,0–25,8 т.п.о.

Ко второй группе относятся хромосомы, на которых летальные гены образуют несколько участков с разной периодичностью. Для относящихся к