Экспрессия генов Патрушев

471

Однонуклеотидная брешь затем заполняется с помощью ДНК-полимеразы, и фосфодиэфирная связь восстанавливается в реакции лигирования. У E. coli репаративный синтез ДНК выполняет ДНК-полимераза I, у дрожжей – ДНКполимераза δ. Из трех ДНК-лигаз, которыми обладают клетки животных, в BER, по-видимому, участвует ДНК-лигаза III.

Рис. I.58. Основные пути и этапы эксцизионной репарации у животных

Цифрами обозначены последовательные этапы функционирования BER и NER

В последнее время начаты исследования механизмов сопряжения BER с другими генетическими процессами, протекающими внутри клеток: транскрипцией, репликацией ДНК и регуляцией клеточного цикла. Для соматических клеток менее опасно иметь повреждения ДНК, связанные с появлением некодирующих (AP-) участков, чем ошибочно кодирующих

472

оснований, поскольку последние приводят к образованию мутаций, тогда как первые допускают осуществление полноценной пострепликативной репарации повреждений. ДНК-гликозилазы, участвующие в BER, способны переводить сайты, содержащие модифицированные основания (например урацил), в некодирующие сегменты одной из цепей ДНК. Урацилгликозилазы, ассоциированные с белковыми комплексами репликативных вилок, действуют очень эффективно на одноцепочечные ДНК, и их активность регулируется во время клеточного цикла.

Эксцизионная репарация ДНК путем удаления нуклеотидов (NER).

Если в системе BER происходит удаление отдельных поврежденных азотистых оснований ДНК путем разрыва соответствующих N-гликозидных связей между азотистыми основаниями и остатками дезоксирибозы, то в системе NER поврежденные азотистые основания вырезаются в составе олигонуклеотидов. NER может осуществляться двумя путями. В первом случае происходит гидролиз фосфодиэфирной связи по 3’- или 5’-концу на некотором расстоянии от ошибочно спаренного (поврежденного) нуклеотида, который далее целиком удаляется под действием 5’→3’- (или 3’→5’-) экзонуклеазы, гидролизующей цепь ДНК нуклеотид за нуклеотидом в соответствующем направлении от первоначального одноцепочечного разрыва в репарируемой ДНК. Образующаяся брешь далее заполняется ДНК-полимеразой. Такой механизм репарации реализуется у E. coli и человека для вырезания неповрежденных (немодифицированных) ошибочно спаренных нуклеотидов. Механизм последовательного эндо- и экзонуклеазного расщепления ДНК не используется для удаления поврежденных (измененных) нуклеотидов. Это связано, повидимому, с тем, что такие нуклеотиды (например возникшие в результате образования аддуктов с мутагенами) часто являются ингибиторами экзонуклеаз.

Одним из решений данной проблемы представляется использование ферментной системы, которая вносила бы одноцепочечные разрывы по обе стороны от поврежденного нуклеотида на некотором расстоянии от него с последующим удалением одноцепочечного фрагмента ДНК, содержащего измененный нуклеотид. Действительно, такой второй механизм эксцизионной репарации функционирует у всех исследованных видов живых организмов и будет рассмотрен ниже более подробно.

473

В универсальном механизме эксцизионной репарации как прокариоты, так и эукариоты гидролизуют 3–5-ю фосфодиэфирную связь с 3'-конца от повреждения (см. рис. I.56). При этом прокариоты гидролизуют также 8-ю связь от 5’-конца измененного нуклеотида, тогда как у эукариотических организмов происходит одноцепочечный разрыв на расстоянии 21–25 нуклеотидов от повреждения со стороны его 5’-конца. Таким образом, прокариоты удаляют измененный нуклеотид в составе 12–13-членных олигомеров, тогда как эукариоты – в составе одноцепочечных фрагментов ДНК длиной в 27–29 нуклеотидов. Ферментная система, вносящая такие двойные одноцепочечные разрывы, получила название эксцизионной нуклеазы (эксцинуклеазы).

Образующаяся в молекуле репарируемой ДНК одноцепочечная брешь далее заполняется с помощью ДНК-полимеразы, а фосфодиэфирная связь в остающемся одноцепочечном разрыве восстанавливается ДНК-лигазой.

Генетика NER. Гены NER E. coli uvrA, uvrB и uvrC не обнаруживают гомологии с соответствующими генами человека. В отличие от них гены NER дрожжей и человека высокогомологичны, и энзимология эксцизионной репарации в этих двух системах также обладает большим сходством. По крайней мере, три заболевания у человека вызываются генетическими нарушениями системы эксцизионной репарации: пигментная ксеродерма, синдром Кокейна и трихотиодистрофия.

Кожа больных пигментной ксеродермой обладает повышенной чувствительностью к дневному свету, что проявляется в виде фотодерматозов, включая рак кожи. В ряде случаев отмечены аномалии нервной системы, причиной которых являются мутации в одном из семи генов: XPA, XPB, ...XPG. Однако описаны больные с классическими симптомами пигментной ксеродермы, но с ненарушенной системой NER. Для клеток этих больных характерны изменения в так называемой пострепликативной репарации. Больным с синдромом Кокейна присущи нарушения роста, умственная отсталость, катаракты, повышенная чувствительность к свету с сопутствующими дерматозами. Обнаружены мутации в двух группах генов, приводящие к этому заболеванию. У больных с мутантными генами CS-A или CS-B клетки способны нормально репарировать УФ-повреждения ДНК. У другой группы больных обнаружены мутации в генах XPB, XPD или XPG. У больных трихотиодистрофией со смешанными симптомами выявлены мутации в генах

474

XPB или XPD. Классические симптомы этого заболевания, по-видимому, являются следствием мутации в гене транскрипционного фактора TFIIH.

Получение мутантов с измененной NER у грызунов позволило разбить такие гены на 11 групп комплементации, большинство из которых соответствует группам комплементации XP и CS человека. Часть соответствующих генов человека удалось клонировать, используя их способность исправлять (комплементировать) генетические дефекты в культивируемых мутантных клетках грызунов. Эти гены получили название кросс-комплементирующих генов эксцизионной репарации (ERCC – excision repair cross complementing).

Среди них гены XPE и ERCC6–ERCC11 не требовались для прохождения основных реакций эксцизионной репарации, и их функция неизвестна.

Структура и функции белков NER. В табл. I.21 суммированы некоторые свойства белков животных, участвующих в NER. Большинство таких белков существует in vivo в виде комплексов, поэтому необходимо иметь в виду, что ферментативные активности, обнаруживаемые у отдельных

белков в очищенном состоянии, могут не иметь прямого отношения к их функциям в системе NER.

XPA – белок с молекулярной массой 31 кДа, обладает доменом типа "цинковые пальцы", участвует в распознавании поврежденного участка ДНК. Он также взаимодействует с другими компонентами системы и может функционировать в качестве фактора нуклеации для экзонуклеазы. XPA взаимодействует своим N-концевым доменом с гетеродимером ERCC1–XPF, а С-концевым доменом – с TFIIH. Кроме того, белок RPA (HSSB) образует комплекс с XPA и усиливает его специфичность в отношении поврежденной ДНК.

RPA (HSSB) – тример, состоящий из белковых субъединиц р70, р34 и р11, необходим для репликации ДНК и репаративного синтеза, а также для прохождения этапа двойного надреза ДНК во время эксцизионной репарации. Он обладает умеренным сродством к поврежденной ДНК.

TFIIH – олигомерный комплекс, в состав которого входят белки р89, р80, р62, р44, р41, р38 и р34. Этот белковый комплекс первоначально был открыт как один из семи основных факторов транскрипции, необходимых для эффективного функционирования РНК-полимеразы II. Случайно было установлено, что его субъединица р89 идентична белку репаративного комплекса XPB, а также обнаружено отсутствие функциональной комплементации между бесклеточными экстрактами клеток с мутантными белками XPB и XPD, определяемой по восстановлению репарирующей активности в смешанных экстрактах. Все это привело к пониманию того, что весь комплекс TFIIH представляет собой фактор репаративной системы. Белки XPB и XPD являются ДНК-зависимыми АТРазами, обладают так называемыми хеликазными доменами и могут (как и сам фактор TFIIH) вызывать

476

диссоциацию гибридов, образованных между короткими фрагментами ДНК и одноцепочечной ДНК.

XPC – белок с молекулярной массой 125 кДа, существует в виде гетеродимера в комплексе с белком р58, который является гомологом белка Rad23 дрожжей (HHR23B). XPC слабо связывается с TFIIH и очень прочно – с одноцепочечной ДНК.

ERCC1/XPF – чрезвычайно прочный белковый комплекс, с которым взаимодействует белок XPA. Он обладает эндонуклеазной активностью, специфичной в отношении одноцепочечной ДНК.

XPG – белковый комплекс, обладающий эндонуклеазной активностью, специфичной в отношении одноцепочечной ДНК; вовлекается в эксцизионный комплекс посредством взаимодействия с TFIIH и RPA.

Механизм NER. Процесс NER условно можно разделить на четыре этапа: а) распознавание поврежденного участка ДНК; б) двойное надрезание (инцизия) цепи ДНК по обеим сторонам поврежденного участка и его удаление (эксцизия); в) заполнение бреши в процессе репаративного синтеза; г) лигирование оставшегося одноцепочечного разрыва ДНК. Феномен NER, как и многие другие генетические явления, имеющие общебиологическое значение, впервые обнаружен у E. coli. Было установлено, что мутантные УФчувствительные клетки E. coli не могут удалять из ДНК тиминовые димеры, возникающие в ответ на действие УФ-света. Вскоре стало ясно, что система эксцизионной репарации не является специфичной в отношении только тиминовых димеров, но способна распознавать и удалять любые повреждения ДНК, возникающие в результате ковалентных модификаций составляющих ее мономеров. Для понимания механизмов узнавания системой эксцизионной репарации поврежденных участков ДНК необходимо ответить, по крайней мере, на три важных вопроса: 1) распознает ли система только поврежденные (модифицированные) основания в ДНК; 2) как система осуществляет выбор цепи ДНК для репарации; 3) каковы молекулярные механизмы распознавания поврежденных участков?

Оказалось, что поврежденные (модифицированные) основания – не единственный субстрат для этой ферментной системы. NER человека распознает и удаляет одиночные ошибочно спаренные нуклеотиды, а также петли длиной в 1–3 нуклеотида. Однако в отличие от истинной репаративной

477

системы, удаляющей неправильно спаренные основания, NER не может идентифицировать, нуклеотид какой цепи ДНК оказывается правильным. В результате происходит вырезание неспаренных нуклеотидов из любой цепи случайным образом. В отличие от только что рассмотренной ситуации NER человека способна различать цепи ДНК в случае распознавания поврежденных нуклеотидов. В частности, показано, что при наличии в ДНК димеров тимина циклобутанового типа вырезание нуклеотидов происходит исключительно из поврежденной цепи. Механизм такого распознавания в настоящее время неизвестен. К сожалению, остается непонятным и молекулярный механизм узнавания самих поврежденных оснований. Следует заметить, что система способна распознавать повреждения как сильно, так и слабо деформирующие вторичную структуру ДНК. При этом не обнаружена линейная зависимость между коэффициентом специфичности нуклеазы (kcat/km) и уровнем деформации двойной спирали ДНК. Показано, что в процессе распознавания участвуют белковые комплексы XPA/RPA, которые преимущественно связываются с поврежденной ДНК, и TFIIH, обладающий АTP-зависимой ДНКрасплетающей активностью. Последний взаимодействует с поврежденным участком ДНК и по аналогии с соответствующим механизмом у E. coli локально раскручивает ДНК, создавая основной преинцизионный комплекс с поврежденной ДНК.

Недавно было установлено, что три фермента репарации, обладающие узкой субстратной специфичностью: ДНК-фотолиаза (удаление пиримидиновых димеров), урацилгликозилаза (удаление урацила из ДНК) и экзонуклеаза III (гидролиз ДНК в AP-сайтах), втягивают поврежденный участок из двойной спирали в полость фермента, что приводит кофактор или аминокислотные остатки активного центра этих ферментов в непосредственный контакт с расщепляемыми связями ДНК. Не исключено, что система эксцинуклеазы действует таким же образом.

Основные этапы функционирования NER, следующие за распознаванием поврежденного участка ДНК, представлены на рис. I.59. После того как комплекс XPA–RPA связывается с измененным участком ДНК, XPA взаимодействует с комплексом TFIIH, который создает преинцизионный комплекс, что сопряжено с гидролизом ATP. ATP-зависимое расплетание ДНК комплексом TFIIH подготавливает ее к взаимодействию с двумя XP-белками,

478

обладающими нуклеазной активностью. XPG связывается с TFIIH и вносит одноцепочечный разрыв с 3’-конца повреждения. Аналогично комплекс ERCC1– XPF взаимодействует с XPA в составе преинцизионного комплекса и способствует одноцепочечному разрыву с 5’-конца повреждения. Образование обоих разрывов является ATP-зависимым, и их расположение на ДНК высокоспецифично. Как правило, происходят разрывы 5-й и 24-й фосфодиэфирных связей соответственно от 3’- и 5’-концов поврежденных участков. Однако расположение точек разрывов может варьировать (см. выше). Таким образом, в результате подобных одноцепочечных надрезов ДНК может освобождаться фрагмент длиной 24–32 нуклеотида с преобладанием фрагментов длиной 27–29 нуклеотидов. На расположение сайтов одноцепочечных разрывов оказывают влияние как характер повреждения, так и последовательности нуклеотидов (контекст), окружающих поврежденный участок. Ту же самую картину инцизии обнаруживают in vivo в ооцитах Xenopus и у Schizosaccharomyces pombe. На этом основании делают вывод об универсальном механизме эксцизионной репарации у эукариот.

479

Рис. I.59. Модель эксцизионной репарации (NER) у млекопитающих

Обозначены белок-белковые и белково-нуклеиновые взаимодействия, возникающие при функционировании NER. A–F – продукты генов XPA–XPF

Репаративный синтез ДНК у человека является PCNA-зависимым (см. раздел 4.1.3), т.е. может осуществляться с участием ДНК-полимераз Polδ и

Polε. PCNA связывается с системой праймер–матрица под действием фактора

480

репликации RFC, откуда следует, что последний также участвует в репаративном синтезе ДНК. В опытах с бесклеточными системами моноклональные антитела к Polδ специфически подавляют репаративный синтез. Однако оказалось, что в тех же высокоочищенных бесклеточных системах вместо Polδ с аналогичным эффектом могут быть использованы Polε и даже фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Это означает, что реконструированные из очищенных компонентов бесклеточные системы лишь в ограниченной степени имитируют биохимические процессы, происходящие в живых клетках. В настоящее время считается, что обе ДНК-полимеразы – Polδ и

Polε участвуют в репаративном синтезе ДНК у человека.

Сопряжение NER с транскрипцией. Транскрибируемые последовательности нуклеотидов ДНК, особенно в матричной цепи, репарируются с большей скоростью, чем нетранскрибируемые последовательности. Интересно, что в клетках больных с синдромом Кокайна не наблюдается такой асимметрии в репарации.

В клетках E. coli белковый фактор, кодируемый геном mfd и сопрягающий транскрипцию и репарацию, замещает остановившиеся перед повреждением молекулы РНК-полимеразы, что приводит к диссоциации транскрипционного комплекса. При этом он одновременно привлекает экзонуклеазный репаративный комплекс к поврежденному участку ДНК. В клетках животных ген CSB кодирует белок с молекулярной массой 160 кДа, который содержит так называемый хеликазный домен (мотив) и, возможно, выполняет те же функции, что и белок Mfd у E. coli. На основе поведения клеток с мутантными генами белков CSA и CSB разработана простая модель механизма, с помощью которого обеспечивается асимметричная репарация цепей ДНК. В соответствии с этой моделью РНК-полимераза II, остановившаяся в процессе транскрипции перед поврежденным участком ДНК, распознается комплексом CSA–CSB и перемещается в сторону от повреждения без разрушения четвертичной структуры транскрипционного комплекса. Одновременно комплекс CSA–CSB привлекает компоненты репаративной системы XPA и TFIIH к месту повреждения ДНК и помогает сборке эксцинуклеазного комплекса. Нуклеотиды поврежденной цепи вырезаются, и брешь репарируется. После этого РНКполимераза в составе транскрипционного комплекса продолжает