Экспрессия генов Патрушев

451

содержащей все вышеупомянутые белки, а также фрагмент одноцепочечной ДНК с единственным мутантным сайтом без одного азотистого основания. Способность ДНК-полимеразы III преодолевать поврежденный участок ДНК в отсутствие UmuD’, UmuC или RecA была оценена в 0,5%, однако при наличии всех компонентов в реакционной смеси эффективность преодоления поврежденного участка увеличивалась в 10 раз. Очищенная ДНК-полимераза I не заменяет ДНК-полимеразу III в этих опытах. Настоящая роль белкового комплекса (UmuD’)2–UmuC в данном процессе неизвестна. Предполагают, что комплекс может изменять процессивность ДНК-полимеразы, подавлять ее корректирующую 3’→5’-экзонуклеазную активность или изменять конформацию фермента на такую, при которой она начинает неадекватно оценивать пространственную структуру комплекса, образующегося с участием Уотсон– Криковских водородных связей между нуклеотидом матрицы и очередным входящим нуклеотидом. Любое из этих изменений должно сопровождаться повышением частоты ошибочного включения нуклеотидов. Недавно (1998 г.) было установлено, что тример (UmuD’)2–UmuC сам по себе обладает слабой ДНК-полимеразной активностью и, возможно, именно этот комплекс осуществляет синтез ДНК непосредственно в поврежденном участке в присутствии всех вышеупомянутых компонентов. В этой связи тример получил название ДНК-полимеразы V Е. coli.

Белок Rev1 дрожжей, гомологичный белку UmuC E. coli, в очищенном состоянии обладает способностью неспецифически включать остатки dCMP в строящуюся цепь ДНК на участке матрицы, в котором отсутствуют азотистые основания. На этом основании он был отнесен к ДНК-полимеразам и был назван дезоксицитидилтрансферазой.

Уникальными свойствами обладает новая ДНК-полимераза IV E. coli, кодируемая геном dinB, которая также участвует в SOS-ответе бактерий. Очищенная до состояния, близкого к гомогенному (1999 г.), она не обладает 3'→5'-экзонуклеазной активностью и способна включать нуклеотиды в строящуюся цепь ДНК по высокодистрибутивному механизму. При каждом контакте фермента с субстратом и гибридом праймер–матрица к праймеру присоединяется единственный нуклеотид. В том случае, если вблизи 3'-конца праймера присутствует ошибочно спаренный нуклеотид (особенно пара G–G), то ДНК-полимераза IV в процессе синтеза ДНК осуществляет сдвиг рамки

452

считывания в результате делеции одного нуклеотида. Такой механизм может потенциально исправить мутагенные последствия смещения 3'-конца праймера по отношению к правильной рамке считывания в поврежденной ДНК-матрице. Полагают, что если во время репликации участков ДНК с простыми повторяющимися последовательностями в результате их повреждения происходит включение неправильно спаренного нуклеотида с последующим проскальзыванием 3'-конца строящейся цепи ДНК и образованием мутации со сдвигом рамки считывания, то происходит задержка репликативного комплекса и его диссоциация. В этих условиях синтез ДНК может быть продолжен ДНКполимеразой IV, которая путем внесения дополнительных мутаций может исправить первоначальный сдвиг рамки.

Таким образом, SOS-мутагенез дает возможность микроорганизмам преодолевать летальное действие повреждений ДНК, что особенно важно при нарушениях ее структуры, которые блокируют репликацию ДНК и с которыми не справляется обычная репаративная система. В этом смысле наиболее опасны одноцепочечные бреши, в которых сохранившаяся цепь не содержит азотистых оснований. При таком развитии событий SOS-мутагенез является вторичным процессом – следствием заполнения бреши случайными нуклеотидами. Однако при некоторых видах повреждений во время SOS-ответа в растущую цепь ДНК включаются нуклеотиды, восстанавливающие ее исходную первичную структуру, т.е. происходит истинная репарация повреждений. В этой связи второй функцией SOS-мутагенеза может быть предоставление микроорганизму возможности противостоять определенным генотоксическим воздействиям окружающей среды, а именно таким классам химических мутагенов, последствия действия которых не преодолеваются системами эксцизионной или иной репарации, функционирующими с высокой точностью. Система SOSмутагенеза, по-видимому, обеспечивает протекание последовательности реакций, обозначаемых как "повторный старт репликации", что имеет место после временной (на 30–45 мин) задержки синтеза ДНК в ответ на ее повреждения генотоксическими агентами. Не исключено также, что SOSмутагенез создает бактериальным клеткам определенные эволюционные преимущества, так как способствует поддержанию генетического разнообразия в популяциях этих микроорганизмов.

453

5.1.3. Мутаторный фенотип

Несмотря на обилие эндогенных и экзогенных мутагенов, лишь небольшая часть их взаимодействий с ДНК завершается образованием мутаций. Для того чтобы исходное повреждение ДНК в виде аддукта, апуринового сайта или одноцепочечного разрыва закрепилось в геноме в виде мутации, ему необходимо избежать нейтрализующего действия многочисленных ферментов системы репарации ДНК. В экспериментальных условиях для получения требуемых мутаций с помощью химических мутагенов и последующего скрининга требуется большая доза суммарного мутагенного воздействия. Из экспериментальных кривых "доза–эффект" видно, что число возникающих мутаций прямо пропорционально дозе мутагенного воздействия. Исходя из этого уже a priori можно предположить, что повреждение отдельных компонентов системы репарации должно приводить к возрастанию выхода мутаций в ответ на определенную дозу мутагенного воздействия. Действительно, описаны многочисленные штаммы микроорганизмов и линии соматических клеток с повышенными частотами спонтанных мутаций. Совокупность признаков организма, для которой характерна повышенная частота образования спонтанных мутаций, получила название мутаторного фенотипа.

Исследование молекулярно-генетических механизмов, приводящих к формированию мутаторного фенотипа, позволило обнаружить отдельные гены, ответственные за этот процесс. Такие гены называют генами-мутаторами, или просто мутаторами. Прежде всего, к ним относятся многие гены системы репарации ДНК, контролирующие разные ее этапы (подробнее см. раздел 5.3). Другие гены, мутации в которых приводят к мутаторному фенотипу, кодируют ферменты матричного синтеза нуклеиновых кислот. Описаны мутационные замены отдельных аминокислотных остатков в ДНК-полимеразах, которые понижают специфичность выбора дезоксирибонуклеозидтрифосфатов из внутриклеточного пула в соответствии с последовательностью матричной ДНК. Следствием этого является повышение частоты включения некомплементарных матрице нуклеотидов в строящиеся цепи ДНК. Однако сам процесс включения некомплементарных матрице нуклеотидов является лишь одной из стадий, критических для контроля точности репликации ДНК.

454

Благодаря наличию у ДНК-полимераз корректирующей 3’→5’-экзонуклеазной активности ошибочно включенные некомплементарные матрице нуклеотиды тотчас удаляются из строящейся цепи ДНК, что защищает ее от точковых мутаций, возникающих по такому механизму. Поэтому неудивительно, что мутации, нарушающие функционирование корректирующей экзонуклеазной активности, также приводят к возникновению мутаторного фенотипа. К аналогичным эффектам приводят нарушения функционирования систем рекомбинации, транскрипции, систем контроля структуры хроматина, ферментных систем, контролирующих сегрегацию хромосом и число копий индивидуальных генов, а также систем, участвующих в синтезе эндогенных мутагенов. Нарушения функционирования и координации экспрессии генов метаболизма нуклеотидов также приводят к мутаторному фенотипу. Известно, что повышение внутриклеточной концентрации дезоксирибонуклеозидтрифосфатов сверх оптимального уровня понижает точность репликации ДНК. Мутаторный фенотип после возникновения начинает имитировать непрерывное мутагенное воздействие, интенсивность которого зависит от характера повреждений генов-мутаторов.

Мутаторный фенотип у микроорганизмов проявляется в повышенной частоте возникновения спонтанных мутаций, которые можно измерить по частоте появления клеток, выживающих в селективных условиях, например в присутствии антибиотиков. У эукариот мутаторный фенотип часто сопровождается дестабилизацией генома, обнаруживаемой по возрастанию частоты внутригеномных перестроек ДНК. В связи с этим явлением наиболее интенсивно исследуются изменения структуры микросателлитных повторов в геноме человека при онкологических заболеваниях. Сравнение структуры отдельных микросателлитных локусов в клетках опухолей и нормальных тканей одного индивидуума часто обнаруживает существенные различия между микросателлитами одного и того же локуса. Такого рода исследования чаще всего проводятся с помощью ПЦР или любого другого метода, используемого при ДНК-типировании (см. главу 10).

455

Рис. I.54. Примеры нестабильности микросателлитов (а, на примере карциномы молочной железы) и потери гетерозиготности (б, на примере глиомы) при различных онкологических заболеваниях. Показаны продукты ПЦР после разделения с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Н – нормальная ткань, О – опухоль. Стрелки указывают на измененные аллели

Наиболее просто обнаруживаются два типа изменений микросателлитов при мутаторном фенотипе (рис. I.54). При одном из них изменение суммарной длины микросателлитных повторов конкретного генетического локуса обнаруживают по возрастанию или уменьшению электрофоретической подвижности соответствующих продуктов ПЦР при сравнении его состояния в опухолевых и нормальных тканях одного и того же организма (см. рис. I.54,а). В исследованиях подобного рода часто наблюдают эффект так называемой потери гетерозиготности исследуемых микросателлитных локусов. Ввиду диплоидности генома человека каждый микросателлитный локус в нем представлен двумя копиями и, следовательно, двумя аллелями в случае его гетерозиготности. При ее потере происходит выравнивание длины обоих микросателлитных аллелей, которые различаются в нормальных тканях, или удаление одного из аллелей в результате делеции. Удаление фиксируют электрофоретически по исчезновению одного из продуктов ПЦР после амплификации соответствующих локусов, не сопровождаемому появлением

456

новых полос (см. рис. I.54,б).

Дестабилизация микросателлитных локусов в опухолевых клетках, повидимому, не служит непосредственной причиной малигнизации этих клеток. Нестабильность микросателлитов скорее может быть чувствительным маркером мутаторного фенотипа раковых клеток, внешним проявлением дестабилизации генома, характерного для опухолевых клеток многих типов. Варьирование размеров микросателлитных локусов является частным случаем большой группы мутаций, связанных с изменением числа копий последовательностей нуклеотидов в геноме эукариот. В качестве еще одного примера мутаций этого рода рассмотрим изменения размеров небольших кластеров ди- и тринуклеотидных повторов в геномной ДНК. Недавно было установлено, что такие мутации, получившие название экспансии ДНК, лежат в основе многих тяжелых заболеваний человека.

5.1.4. Экспансия ДНК

Под экспансией ДНК понимают увеличение числа копий коротких повторяющихся последовательностей нуклеотидов внутри кластера при передаче генетической информации от родителей потомкам. В настоящее время различают два класса этих генетических явлений. При экспансии ДНК первого класса происходит резкое и стабильное увеличение числа копий определенных повторов (≥10) на фоне полного отсутствия обратного сокращения длин их кластеров. При экспансии ДНК второго класса изменения затрагивают меньшее число повторов (≤4), а образование мутационных вставок и обратных делеций повторяющихся последовательностей происходит с одинаковой скоростью. Мутации первого класса ассоциируются с болезнью Хантингтона, синдромом ломкости X-хромосомы, болезнью Кеннеди, миотонической дистрофией, спиноцеребральной атаксией типа I и рядом других неврологических заболеваний. У здоровых индивидуумов имеет место полиморфизм по числу копий повторяющихся единиц в этих локусах, и экспансия повторов приводит к развитию таких заболеваний после того, как количество копий повторяющихся единиц (как правило, тринуклеотидов) начинает превышать определенное значение. В результате изменяется уровень экспрессии гена, содержащего повторы, или же свойства кодируемого

457

геном белка. Экспансия динуклеотидов CA или AT, относящаяся ко второму классу мутаций, ассоциируется чаще всего с наследственным раком кишечника.

В наследовании предрасположенности к экспансии ДНК имеет место импринтинг (см. раздел 3.2.5). Процесс экспансии происходит во время митотической репликации ДНК на ранних стадиях эмбриогенеза. Для развития синдрома ломкости X-хромосомы только в материнской X-хромосоме должен образовываться премутационный аллель, содержащий 50–200 копий тринуклеотида CGG. При наличии такой премутации в эмбриональном развитии мужской особи формируется мутантный аллель, содержащий 200–2000 копий этого повтора. Подобной экспансии ДНК никогда не происходит, если премутация локализована на отцовской X-хромосоме. Приведенный пример с синдромом ломкости X-хромосомы указывает на необходимое условие для экспансии ДНК и во всех остальных случаях: увеличение числа копий повторов у родителей до определенного порогового значения. Как только формируется премутантный аллель в геноме родителей, у следующего поколения происходит образование истинно мутантного аллеля, сопровождаемое развитием соответствующего патологического состояния организма.

458

Рис. I.55. Модели механизма экспансии ДНК во время репликации

а – с проскальзыванием ДНК-полимеразы; б – с участием отстающей цепи ДНК; в – с привлечением механизма конверсии генов

Среди возможных ди- и тринуклеотидных последовательностей лишь для CAG/CTG, CGG/CCG и AT продемонстрирована экспансия in vivo, приводящая к патологиям. Предполагают, что возможность экспансии именно этих, а не других повторов определяется их способностью образовывать стабильные шпильки. Предложены три модели, объясняющие механизм экспансии ДНК, в которых участвуют шпильки, образованные соответствующими повторами (рис. I.55). Первая модель предполагает проскальзывание реплицирующей

459

молекулы ДНК-полимеразы на повторе в обратном направлении, сопровождаемое образованием шпильки в строящейся цепи ДНК (см. рис. I.55,а). В этом случае в следующем раунде репликации или по завершении репаративного синтеза ДНК длина кластера повторяющихся последовательностей увеличится на размер сегмента ДНК, образовавшего шпильку. Согласно второй модели при репликации отстающей цепи ДНК на соответствующем повторе матричная ДНК некоторое время находится в одноцепочечной форме (см. рис. I.55,б). В это время одноцепочечная последовательность отстающей цепи, содержащая повтор, может образовать шпильку, которая блокирует синтез ДНК в данном месте. Предполагается, что белок, связывающийся с одноцепочечной ДНК (SSB-белок), не может эффективно взаимодействовать с двухцепочечной шпилькой, однако сохраняет способность связываться с одноцепочечной петлей на вершине шпильки, обеспечивая инициацию репликации ДНК с этого места. После того как ДНКполимераза прореплицирует одну половину шпильки, ее структура разрушится, что приведет к снятию блока репликации перед шпилькой и ее нормальному продолжению. Однако синтезированный перед этим фрагмент ДНК, соответствующий одной половине шпильки, оказывается лигированным с уже имевшимся фрагментом Оказаки. Он не может отделиться от матрицы, которая своими нуклеотидами, расположенными по концам, образует водородные связи

сповторами матрицы. Далее избыточная последовательность включается в растущую цепь ДНК и после ошибочной репаративной коррекции шпильки приводит к увеличению размера этого кластера повторяющихся последовательностей, т.е. их экспансии. В соответствии с третьей моделью шпильки, образующиеся в местах соответствующих кластеров повторяющихся последовательностей на разных молекулах ДНК, могут взаимодействовать друг

сдругом, что будет сопровождаться возникновением сложно структурированной матрицы для репликации. В процессе синтеза ДНК на такой сложной матрице весьма вероятно включение избыточной последовательности в виде повтора во вновь синтезируемую ДНК (см. рис. I.55,в). Аналогичный эффект может быть достигнут и в результате сложной последовательности событий рекомбинации с участием этих шпилек.

Заканчивая обсуждение недавно обнаруженных "необычных" мутационных изменений геномной ДНК, связанных с увеличением числа копий

460

(экспансией) коротких повторяющихся последовательностей, следует подчеркнуть, что они не изменяют традиционных представлений о мутагенезе. Хотя такие мутации ассоциированы с конкретными генетическими локусами, содержащими повторы определенной структуры, процесс экспансии этих последовательностей носит случайный характер и, возможно, запускается первичным мутационным изменением в кластере повторов, которое делает более вероятным формирование шпилечной или иной пространственной структуры подобных кластеров. Однако не так давно была описана еще одна группа мутаций, само существование которых идет в разрез с общепринятым неодарвиновским представлением о механизмах возникновения мутаций. В следующем разделе речь пойдет об адаптивных мутациях; их возникновение в геноме носит не случайный, а направленный характер.

5.1.5. Адаптивные мутации

Проблема, связанная с возможностью возникновения адаптивных мутаций, имеет глубокие корни в биологии. За 50 лет до того как Ч. Дарвин начал свои знаменитые исследования происхождения биологических видов, другой биолог, француз Ж.Б. Ламарк, разработал учение о возможности наследования признаков, которые родительские организмы приобретали на протяжении жизни под действием окружающей среды. В терминах современной генетики это означает, что организм в ответ на определенное воздействие внешних факторов может целенаправленно изменять свой геном в клетках зародышевой линии таким образом, что он у потомков будет контролировать развитие признаков, максимально адаптированных к изменившимся внешним условиям. Следовательно, по Ламарку организм самостоятельно способен делать выбор между полезными и вредными признаками и тем самым направлять свои эволюционные преобразования. Поскольку любое наследуемое изменение генома представляет собой мутацию, неоламаркистские концепции предполагают, что организм может контролировать мутационные изменения своего генома и направлять их в нужное русло развития признаков, полезных для выживания.

Взгляды неодарвинистов на мутационный процесс прямо противоположны. В соответствии с их доктриной, доминирующей в системе взглядов современных молекулярных генетиков, мутации являются случайными