ЛИТЕРАТУРА

- Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология, 2002 г.

- Рыбчин Н.В. Основы генетической инженерии, 1999 г.

- Патрушев Л.И. Экспрессия генов, 2000 г.

ЛЕКЦИЯ 1.

ВВЕДЕНИЕ.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ.

1. ГИ – искусство использовать знания основ и методов молекулярной биологии для конструирования организмов с заданными наследственными свойствами. (Рыбчин, 1999).

2. ГИ это манипуляция с генами in vitro с целью получения новых рекомбинантных организмов и изучения структуры генов. (Матвиенко Н.И. 2001). Из последнего определения понятно, почему ГИ еще называют технологией рекомбинантных ДНК.

Способность к манипулированию и анализу ДНК с помощью генетической инженерии возникла в середине 60-х годов и стала осуществляться к началу 70-х годов. Эта область знаний основывается на ряде фундаментальных открытий в биохимии и генетике микроорганизмов.

ВАЖНЕЙШИЕ ОТКРЫТИЯ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, ПОСЛУЖИВШИЕ ФУНДАМЕНТОМ ДЛЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ.

История ГИ насчитывает более 30 лет, однако, появлению и развитию ГИ способствовал ряд открытий, сделанных в предшествующие годы. Главнейшие из них:

- 1928 г., открытие Гриффитом трансформации пневмококков;

- 1940-1944 гг. Эвери, МакЛеод, Маккарти обнаружили, что ДНК, а не белок

определяют наследственные свойства организмов;

- 1953 г. Уотсон и Крик предложили двухспиральную модель ДНК, которая объясняла не только структуру самой ДНК, но и каким образом происходит удвоение (репликация) ДНК, один из самых важных для живых организмов процесс – процесс передачи генетической информации;

- 1958 г. возникновение генетической энзимологии. А. Корнберг обнаружил фермент, осуществляющий репликацию ДНК, т.н. ДНК-полимеразу 1 (фермент Корнберга), за что был награжден Нобелевской премией. Его сын. также получил Нобелевскую премию за работы в области молекулярной биологии , но в 2006 г;

1961-1966 гг. расшифрован генетический код и выяснено строение элементов, управляющих действием генов и синтезом белков: промоторов, операторов и т.д.);

- В начале 60-х годов Вернером Арбером было сделано ключевое для ГИ открытие таких ферментов, как рестрикционные эндонуклеазы, которые могли разрезать ДНК в строго определенных местах, что открыло путь к получению рекомбинантных ДНК;

- В это же время в лаборатории Кораны был синтезирован химико- ферментативным путем один из генов кишечной палочки (ген аланиновой тРНК). Интересна реакция на это выдающееся событие некоторых ученых того времени. Один из них сказал: «Подобно проекту «Аполлон» (полет на Луну), все это сделано лишь для того, чтобы показать, что это можно сделать, и как и это проект, никогда не будет повторено». Однако более дальновидным оказался нобелевский лауреат, биохимик Артур Корнберг. «То что вы сделали - сказал он Коране – это атомная бомба 1980 г.» Кстати, до сих пор находятся ученые, которые считают, что дальнейшее развитие ГИ может привести к губительным последствиям для человечества и всей жизни на Земле;

- 1970 г. Открыт фермент обратная транскриптаза (синоним - ревертаза),

который катализирует синтез ДНК, используя в качестве матрицы РНК. До этого полагали, что процесс может идти только в одном направлении ДНК – РНК – белок (т.н. центральная догма молекулярной биологии). Для ГИ это имело важное значение, поскольку матричная РНК содержит информацию, достаточную для синтеза одного или нескольких белков, т.е. эквивалентную одному или нескольким генам. Кроме того, в клетке может быть много копий мРНК одного типа и всего лишь одна молекула ДНК. Используя ревертазу и выделенную РНК можно синтезировать ДНК, содержащую всего один или несколько генов. В 1975 г. используя указанный выше подход, с помощью обратной транкриптазы был синтезирован ген глобина;

НАРИСОВАТЬ НА ДОСКЕ

- 1972-73 гг. считают рубежом создания генетической инженерии, когда в лаборатории Берга была получена in vitro и введена в бактерию E. coli первая рекомбинантная молекула ДНК;

В дальнейшем лавинообразное накопление новых знаний и методов привело к тому, что ГИ превратилась из искусства в ремесло. Наиболее значительные успехи связаны с применением эндонуклеаз рестрикции, молекулярного клонирования, секвенирования нуклеиновых кислот и полимеразной цепной реакции.

Одновременно создавалась индустрия, производящая химикаты, реагенты и оборудование для ГИ, которая в настоящее время приносит прибыль во многие миллиарды долларов.

Развитие ГИ привело к тому, что сейчас возможны манипуляции с геномом любого организма от бактерий до млекопитающих, чтобы осуществить синтез биологических продуктов, которые в норме синтезируются другими организмами. Эта технология не только облегчает продукцию некоторых белков в недоступном ранее количестве, но и открывает возможности для создания совершенно новых, высоко модифицированных биоактивных продуктов. Эта технология используется в широком круге различных производств, в фармацевтической и пищевой промышленности, косметике, охране окружающей среды и т.д.

Предмет и задачи генной инженерии и ее связь с другими биологическими дисциплинами.

В основе современной технологии генной инженерии лежат методы изоляции, разрезания и сшивания молекул ДНК. Эти методы позволяют получать фрагменты ДНК из практически любых организмов, клонировать их в бактериях путем встраивания в векторные молекулы ДНК, которые стабильно поддерживаются в бактерии - хозяине.

РИСУНОК №1

На рисунке представлена в самом общем виде схема получения рекомбинантной ДНК.

1 этап – изоляция и выделение ДНК, содержащей необходимый ген или его часть.

В экспериментальных условиях невозможно работать с одной копией гена, поэтому необходимо получение большого числа идентичных копий гена или его частей. Для этого используется метод молекулярного клонирования.

2 этап – Рекомбинация ДНК. Фрагмент ДНК из какого-то организма вставляется в вектор (плазмида или фаг). Поскольку объединение молекул клонируемой ДНК и ДНК вектора является рекомбинацией, такие гибридные молекулы называют рекомбинантными молекулами. Полученный рекомбинантный вектор должен содержать ген, сообщающий бактерии устойчивость к определенному антибиотику;

3 этап – Трансформация. Рекомбинантная ДНК входит в клетку хозяина и пролиферирует, т.е. размножается. Этот процесс называется трансформацией, поскольку функция клетки хозяина может быть изменена за счет активности чужой ДНК. В обычных условиях плазмидная ДНК с трудом проникает в клетки бактерий. Если клетки обработать хлоридом кальция (CaCl₂), то эффективность трансформации резко увеличивается, но все равно только одна из 10 000 клеток может принять плазмидную молекулу ДНК;

4 этап - селективная амплификация (т.е. увеличение числа копий рекомбинантной ДНК). Специфичный антибиотик, добавленный в среду, убивает клетки, которые лишены защиты от него. В то же время, трансформированные клетки защищены, благодаря гену антибиотико-устойчивости, продукт которого нейтрализует антибиотик. На рисунке видно, что количество векторов в каждой клетке бактерии разное, поскольку они могут копироваться независимо;

5 этап – Изоляция полученных клонов ДНК.

6 этап – получение специфического белкового продукта

Методы выделения и синтеза генов. Основной инструментарий генной инженерии.

Выделение и очистка ДНК.

Прежде всего находят найти нужный ген. Для этого применяется физическое картирование. Это приемы, с помощью которых определяется сайт рестрикции, т.е. место расщепления ДНК. Другой прием заключается в том, что выделяется мРНК, а затем она переводится в ДНК. Для поиска нужного гена используют такие приемы как мечение интересующего фрагмента ДНК флуоресцирующей меткой, а также иммунологические методы с использованием антител.

Для получения большого количества относительно чистой ДНК необходимо механическое или ферментативное разрушение клеток для освобождения их содержимого. Следующий этап - очистка нуклеиновых кислот от белков и полисахаридов. Эта задача решается путем комбинирования использования методов центрифугирования, электрофореза, адсорбции на специфических субстратах или путем осаждения с неводными растворителями. При выделении ДНК используют мягкие условия разрушения клеток и ингибируют такие ферменты как ДНКазы и РНКазы, чтобы предотвратить гидролиз нуклеиновых кислот. Это могут быть, фенол, детергенты или специфические ингибиторы из тканей животных.

Разрезание молекулы ДНК. ДНК можно разрезать, используя механические или ферментативные методы. При первом способе ДНК разрывается гидродинамически при пропускании ее через капилляр. Механические воздействия и приводит к генерации случайных фрагментов ДНК, которые могут быть использованы для создания геномных библиотек. При этом невозможно выделить специфический фрагмент, содержащий определенный ген или оперон. Метод применялся в 60-7- годы.

В противоположность этому, при разрезании ДНК с использованием рестрикционных эндонуклеаз, которые узнают и разрезают специфические последовательности в двухспиральной ДНК (сайты рестрикции), можно выделить специфические фрагменты. Из микроорганизмов разных видов выделено несколько сотен рестрикционных эндонкуклеаз, и их число продолжает расти. Выделяют несколько классов рестрикционных эндонуклеаз с различными биохимическими свойствами.

Для ограничения числа сайтов рестрикции и получения более крупных фрагментов используют ферменты метилазы. Сшивание молекул ДНК происходит с участием ферментов, называемых лигазами. Широко используются также ДНК-полимеразы, ведущие матричный синтез ДНК, среди них обратная транскриптаза, о которой мы упоминали выше.