6.5. Методы выделения и анализа полисахаридов

Природные полисахариды очень разнообразны по своей структуре, поэтому не существует единых подходов к их выделению из биологического материала. Легче всего выделять экзогенные полисахариды, так как они находятся вне клетки. Для этого клетки осаждают, а из раствора удаляют белки и низкомолекулярные полипептиды. Затем осуществляют экстракцию полисахаридов разбавленными растворами солей или органических кислот и их осаждение этанолом или другими органическими растворителями, смешивающимися с водой.

Эндогенные полисахариды (резервные и структурные) выделяют из биологического материала после гомогенизации клеток, что усложняет методику их выделения. В остальном процедура выделения эндогенных полисахаридов аналогична таковой для экзогенных полисахаридов.

Определение структуры полисахаридов является достаточно сложной задачей. Для выделения полисахарида высокой степени чистоты его несколько раз переосаждают из раствора. После этого проводят кислотный или ферментативный гидролиз полисахарида, продуктами которого являются олиго- и моносахариды. Полученный гидролизат анализируют на присутствие моно-, олиго- и полисахаридов с помощью цветных реакций, а также хроматографических методов, либо подвергнутый химической модификации гидролизат анализируют методами хроматомасс-, ЯМР-спектроскопии, электрофореза и др.

Лабораторная работа выделение углеводов и изучение их свойств

Цель работы – освоение методов выделения углеводов из биологического материала и их качественного и количественного анализа.

Реактивы, материалы и оборудование: пекарские дрожжи (прессованные, 75%-ной влажности); клубни картофеля; 1%-ный раствор NaCl; 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; 96%-ный этанол; раствор Люголя (1 г йода и 2,5 г KI растворяют в 20 мл дистиллированной воды; после растворения компонентов объем доводят водой до 100 мл); 2%-ный раствор серной кислоты; гидрокарбонат натрия; 0,2%-ный спиртовой раствор -нафтола; концентрированная серная кислота; 40%-ный раствор сегнетовой соли (K,Na-виннокислый, NaKC₄H₄O₆ · 4H₂O); динитросалициловый реактив; дистиллированная вода; химически чистые пробирки; конические колбы объемом 250 мл; пипетки на 1, 2, 5, 10 мл; автоматические пипетки на 200 и 1000 мкл; шпатели; терка; ступки; центрифужные пробирки; фильтровальная бумага; марля; стеклянные фильтры; кюветы для фотоэлектроколориметра; штативы для пробирок; электронные весы; центрифуга; рН-метр; водоструйный насос; фотоэлектроколориметр.

Выполнение работы

1. Выделение полисахаридов из биологического материала

Выделение крахмала из клубней картофеля. Картофель (2 клубня) очищают от кожуры и измельчают на мелкой терке. Полученную кашицу помещают в колбу и добавляют 30 мл 1%-ного раствора NaCl. Содержимое колбы перемешивают в течение 15 минут и фильтруют через 2 слоя марли. К осадку приливают 20 мл 1%-ного раствора NaCl и полученную суспензию снова фильтруют. При этом в осадке находятся клеточные стенки, а в фильтрате – плохо растворимые белки, низкомолекулярные соединения и крахмальные зерна. Фильтраты объединяют и оставляют на некоторое время для осаждения зерен крахмала. Надосадочную жидкость сливают, а осадок промывают холодной водой 23 раза, ресуспендируют его в 20 мл 96%-ного этанола и полученную суспензию центрифугируют при 5000 мин^1 в течение 5 мин. Осадок крахмала промывают 2030 мл 96%-ного этанола и высушивают на стеклянном фильтре с помощью водоструйного насоса.

Выделение гликогена из клеток пекарских дрожжей. Навеску (10 г) замороженных пекарских дрожжей (прессованных, 75%-ной влажности) растирают в охлажденной фарфоровой ступке с 15 мл охлажденного 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) в течение 15 мин. Затем суспензию центрифугируют при 5000 мин^1 на протяжении 15 мин. Полученный осадок дважды экстрагируют аналогичным образом, добавляя к нему по 5 мл 10%-ного раствора ТХУ. В процессе экстракции в раствор переходят гликоген и низкомолекулярные вещества, а белки и нуклеиновые кислоты остаются в осадке. Экстракты объединяют и вносят при перемешивании в 96%-ный этанол, взятый в количестве 2,5 объема от объема экстракта. При этом низкомолекулярные вещества остаются в растворе, а гликоген выпадает в осадок. Осадок гликогена отделяют центрифугированием при 5000 мин^1 в течение 15 мин, промывают 20 мл 96%-ного этанола и высушивают на стеклянном фильтре с помощью водоструйного насоса.