В 1960 г. французский ученый Ж. Барский выращивал в культуре клетки двух линий мышей и обнаружил, что некоторые из них по своим морфологическим и биохимическим свойствам оказались промежуточными между исходными родительскими клетками. Это были гибридные клетки. Такое спонтанное слияние соматических клеток в культуре ткани происходит довольно редко.
В смешанной культуре разных типов клеток образуются гетерокарионы — клетки, содержащие два ядра разных клеток в одной цитоплазме. Часть таких клеток способна размножаться митозом. После митоза из двуядерного гетерокариона образуются две одноядерные клетки, каждая из которых представляет собой синкарион — настоящую гибридную клетку, содержащую хромосомы обеих родительских клеток, то есть происходит объединение двух геномов.
Гибридизация возможна между клетками не только организмов разных видов (человек — мышь), но и разных типов (человек — комар). Синкарионы обычно удается получать при гибридизации в пределах класса. Например, гибридные клетки человека и мыши имеют 43 пары хромосом: 23 — от человека и 20 — от мыши. В дальнейшем происходит постепенное удаление хромосом того организма, клетки которого имеют более медленный темп размножения. У гибридных клеток человека — мыши удаляются хромосомы человека.
В гибридных клетках функционируют хромосомы как человека, так и мыши, гены которых детерминируют синтез соответствующих белков. Морфологически можно отличить каждую из хромосом (дифференциальное окрашивание). Если в гибридной клетке отсутствует какая-либо хромосома и не происходит синтез каких-то белков, то можно предположить, что гены, детерминирующие синтез этих белков, локализованы в ней.
Таким образом, этот метод позволяет устанавливать группы сцепления у человека, используя нехватки и транслокации, — выяснять и последовательность расположения генов, то есть строить генетические карты хромосом человека.
Молекулярно-генетический метод
Для молекулярной диагностики доступны более 500 наследственных заболеваний. В России диагностируются около 200.
Преимущества ДНК-диагностики:
возможность использовать для анализа любые клетки и ткани, которые содержат ДНК.
проведение анализа на любой стадии онтогенеза.
Виды ДНК-диагностики
Прямая.
Можно использовать только для наследственных заболеваний, имеющих клонированные гены с известной нуклеотидной последовательностью. Основная задача – идентификация мутаций в гене.
Например, делеции при муковисцидозе, при ФКУ.
Преимущества: высокая точность диагностики и отсутствие необходимости анализа всей семьи.
Недостаток: применим только для известной мутации.
Косвенная.
Используется, если мутации в гене не найдены или отсутствуют частые мутации.
Диагностика основана на использовании сцепленных с геном полиморфных маркеров, расположенных на близком расстоянии или внутри гена.
Преимущество: нужно знать только область гена. Недостатки: а) область расположения гена должна быть небольшой, так как рекомбинация может нарушить сцепление признака с маркером,
б) обязательно наличие родителей пробанда, так как нужно определить мутантные аллели и проследить их передачу пробанду,
в) информативность не более 70%.
ПЦР – полимеразная цепная реакция
Метод разработан Кэрри Мюллисом в 1983 году.
ПЦР – селективная амплификация (клонирование) фрагмента ДНК in vitro.
ПЦР – модель биологических процессов репликации ДНК.
Включает 3 стадии:
денатурация двух цепочек молекулы ДНК (расплетение двойной спирали и расхождение нитей).
Гибридизация (отжиг) праймеров с матричной ДНК (образование двухцепочечных комплексов «праймер – матрица», которые необходимы для инициации синтеза ДНК).
достраивание (удлинение, элонгация) комплементарных цепей в направлении 3\---5\.
