Лекция_3_ГИ_М_2014
.pdf
Анализ экспрессии трансгена методом
RT-PCR
•Полуколичественный анализ уровня экспрессии – сравнение уровня транскрипции целевого гена и гена домашнего хозяйства
914 п.н. 
107 п.н.
ПЦР в реальном времени
Суть метода – вместе с
праймерами (прямым и обратным) добавляется
флуоресцентный зонд и проводят ПЦР
Анализ результатов – сравнение экспрессии целевого гена и гена домашнего хозяйства
Примеры оценки уровня экспрессии по мРНК
Концепция «лимитирующего звена» в приложении к процессу экспрессии
Высокий уровень экспрессии
Транскрипц |
Процессинг |
Трансляция |
Стабильность |
|
|||
ия |
|
|
|
Низкий уровень экспрессии
ДНК |
пре- |
мРН |
Белок |
|
мРНК |
|
|
Низкий уровень экспрессии ( |
- низкоэффективные |
стадии) |
|
Анализ белкового продукта трансгена
Метод чашечного теста
При наличии специфической активности
К+ К-
Метод энзимограмм |
|
K RL LR LR LR |
RL M |
70
55
40
35
25
15
10
кДА
Уровень накопления белкового продукта трансгена по его ферментативной активности
ед.акт/мкг сумарного белка
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
|
9 |
|
|
|
|
|
|
4 |
|
-10 |
-11 -12 |
-13 |
||||||||||
|
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|||||
-DAL -DAL -DAL -DAL -DAL -DAL -DAL -DAL -DAL |
|
|
|
|
|
|
|||||||||
35S |
35S |
35S |
35S |
35S |
35S |
35S |
35S |
|
-DAL -DAL -DAL -DAL |
||||||
35S 35S |
|
35S |
35S |
35S |
|
||||||||||
Анализ содержания 18:2, 18:3 жирных кислот в разных линиях desA трансформантов картофеля
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
мкг/мольЛиния W Линия A Линия C
Линии W контроль
|
Линии А |
|
∆9,12-18:2 |
||
DesA |
||
∆9,12,15-18:3 |
|
Линии С
DesA-LicBM3
Вестерн-блот гибридизация
Вестерн-блот гибридизация
Вестерн-блот гибридизация