005 lec bio

Получение

продуцентов

продолжение...

1

Получение кДНК для клонирования

2

Введение гена в плазмиду E. coli и клонирование рекомбинантной ДНК в клетках

3

Введение рекомбинантной ДНК в организм-реципиент

Особенности пермиссивных клеток:

•1. Внутриклеточные нуклеазы не разрушают включаемую ДНК или РНК.

•2. Вектор способен реплицироваться в пермиссивной клетке.

•3. Выраженная активность промотора и/или терминатора транскрипции рДНК.

•4. Сплайсинг РНК.

•5. Наблюдается эффективная трансляция мРНК.

•6. Нет выраженной активности пептидогидролаз, катализирующих гидролиз экспрессируемых чужеродных белков.

Для включения рДНК в пермиссивные клетки пользуются методами трансформации, инфекции, микроинъекций, электропорации. Ввод рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина называется трансформацией.

4

Электропорация

25 мкФ = 2500 В

при 200 Ω за 5 мс

Импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость мембран.

На клетку действуют высоковольтным импульсом. Через образующиеся на короткое время поры ДНК проникает в клетку.

5

Бомбардировка (баллистическая трансформация)

1)ДНК с целевыми генами, адсорбируется на поверхности микрочастиц (0,6-6 мкм) из инертных металлов -- золота или вольфрама.

2)Частицам сообщается кинетическая энергия, достаточная для прохождения через клеточные стенки.

3)Оказавшись внутри клетки, ДНК с поверхности частиц высвобождается в цитоплазму

6

Микроинъекции

•Механическое введение ДНК в ядра культивируемых клеток млекопитающих, растений.

•Игла стеклянная диаметром 0,1 мкм

Ооциты лягушки

7

Ферменты

8

Ферменты

Ферменты (от лат. fermentum – закваска), энзимы, специфические белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках. Почти все биохимические реакции, протекающие в любом организме и в своём закономерном сочетании составляющие его обмен веществ, катализируются соответствующими ферментами.

9

Ферменты

Ферменты проявляют все свойства белков, их активность зависит от сохранения нативной пространственной структуры. При глубоких изменениях конформации, приводящих к денатурации, ферменты утрачивают активность. Для ряда ферментов показано, что утрата активности при денатурации является обратимой. На основании результатов исследования ренатурации рибонуклеазы К. Анфинсен впервые четко сформулировал представление о том, что пространственное строение белка определяется его первичной структурой.

Ферменты являются высокоэффективными катализаторами; так, например, уреаза (при рН 8.0) способна ускорять гидролиз мочевины в 1010 раз.

10