- •Исследование клеточного цикла у людей, подвергшихся низкоинтенсивному хроническому радиационному воздействию
- •2012 Г. Содержание
- •Введение
- •1. Клеточный цикл
- •1.1. Стадии клеточного цикла
- •1.2. Фазы митоза
- •1.3. Методы изучения регуляции клеточного цикла
- •2. Регуляция клеточного цикла
- •2.1. Циклины и циклинзависимые киназы
- •2.2. Ингибиторы клеточного цикла
- •2.3. Контроль клетки за прохождением клеточного цикла
- •2.3.1. Объекты контроля и сверочные точки
- •2.3.2. Механизм остановки цикла
- •2.4. Датчики атм и атr
- •2.5. Чекпойнт-киназы Chk1 и Chk2
- •2.6. Белок Ki-67
- •3. Нарушения регуляции клеточного цикла и канцерогенез
- •4. Клеточный цикл и ионизирующее излучение
- •5. Проведение методики оценки задержки клеточного цикла лимфоцитов периферической крови методом проточной цитометрии
- •5.1. Выделение лимфоцитов периферической крови человека на градиенте фиколл-урографин
- •5.2. Культивирование лимфоцитов периферической крови человека
- •5.3. Анализ пролиферативной активности лимфоцитов с использованием набора Кi-67
- •5.4. Анализ проб на проточном цитометре
- •Заключение
- •Список использованной литературы
2.5. Чекпойнт-киназы Chk1 и Chk2
Чекпойнт-киназы Chk1 и Chk2 - это серин/треонин-киназы, негомологичные по структуре, но сходные по функциям и субстратам фосфорилирования. Возможно, чекпойнт-киназы, являются опухолевыми супрессорами. В биопсиях мелкоклеточного рака легкого находят мутантную форму Chk2 и минорную изоформу Chk1.
При возникновении повреждений ДНК датчики ATM и ATR фосфорилируют Chk2, в результате чего происходит ее активация. Активированная Chk2, в свою очередь, фосфорилирует различные мишени, среди которых опухолевые супрессоры p53 и BRCA1, а также фосфатаза Cdc25С, играющая важную роль в регуляции G2-чекпойнта.
Так, Chk2 фосфорилирует p53 по Ser-15, "защищая" от атаки Mdm2. У клеток, мутантных по двум аллелям CHK2, нарушены p53-зависимые процессы, такие, как остановка в G1 и апоптоз. Известны случаи синдрома Ли-Фраумени, вызванного мутациями в гене Сhk2, а не p53.
Chk2 колокализована в ядре с опухолевым супрессором BRCA1. Ионизирующее излучение активирует Сhk2, которая, в свою очередь, фосфорилирует BRCA1. При этом BRCA1 также активируется, что сопровождается его выходом из очагов локализации.
Chk2 ингибирует фосфатазу Cdc25С. Видимо, в связи с этим клетки CHK2-/- не способны поддерживать остановку клеточного цикла в G2 (G2-arrest), хотя инициация G2-чекпойнта у них не нарушена.
В отличие от Chk2, активность чекпойнт-киназы 1 не увеличивается в ответ на повреждения ДНК. Тем не менее, показано, что при ДНК-повреждающих воздействиях Chk1 фосфорилируется датчиками ATR и, возможно, ATM. Каким именно образом фосфорилирование Chk1 влияет на ее активность, до конца не выяснено. Предполагается, что в фосфорилированной форме Chk1 легче связывается со своими мишенями.
Функции Сhk1 изучены в меньшей степени, чем Chk2, поскольку мутации CHK1-/- летальны. Мыши, нокаутированные по двум аллелям CHK1, умирают в раннем эмбриогенезе из-за p53-независимого апоптоза эмбриональных стволовых клеток. Тем не менее, удалось показать, что клетки CHK1-/- не способны к остановке клеточного цикла в G2.
Имеются данные, что Сhk1 фосфорилирует p53 in vitro. Однако имеет ли место этот процесс in vivo, пока неизвестно. In vivo выявлено, что p53 при участии опухолевых супрессоров p21waf1 и pRb способен действовать как ингибитор Chk1. Возможно, Chk1 и p53 регулируются реципрокно.
Основной механизм действия Chk1 на клеточный цикл - инактивация фосфатаз Cdc25 A и C.
Chk1-зависимый распад Cdc25A лежит в основе p53-независимой остановки в G1. Роль Chk1 в системе G2-чекпойнта активно изучается. Имеются данные, что Chk1 не только инактивирует Cdc25С, но также активирует Wee1. Таким образом, возможно, Chk1 осуществляет "двойной удар" по комплексу циклин B-Сdk1, задерживая клетки в G2.
2.6. Белок Ki-67
В настоящее время известно несколько ядерных и мембранных антигенов, изменение экспрессии которых связано с пролиферативной активностью клеток. Одним из наиболее изученных молекулярных биомаркеров является показатель пролиферативной активности Ki-67, антитела к антигену которого реагируют с пролиферирующими клетками, находящимися в G1, S, M, G2 стадиях клеточного цикла. Если клетка не пролиферирует, такого взаимодействия не происходит.
На протяжении большей части интерфазы Ki-67 локализован в ядрышке. В начале периода G1, Ki-67 антиген обнаружен в большом количестве дискретных очагов во всей нуклеоплазме, распространяясь на ядерную оболочку. В S- и G2-периодах антиген находится в ядрышке.
С помощью двойной непрямой иммунофлюоресценции было показано, что в начале-середине G1-периода Ki-67 связан с реформированием ядрышек в дискретных доменах, которые отличаются от доменов, содержащих фибрилларин и РНК-полимеразы I.
В онкологии изучение негистонового протеина Ki-67 (маркера пролиферации), экспрессирующегося во всех клетках, вышедших из G0-фазы, представляется актуальным и позволяет определить именно "скрытый" пролиферативный потенциал опухоли и судить о степени злокачественности, а также разделить пациентов на группы с относительно благоприятным и неблагоприятным прогнозом. Пролиферативную активность опухоли оценивают как процент Ki-67-положительных клеток от общего числа опухолевых клеток. При прогрессировании опухоли выявляется тенденция к усилению экспрессии Ki-67.